余甘子对大鼠非酒精性脂肪肝疾病中肝损伤和炎症的抑制作用研究

朱 炜 俞宏斌 戴 闯 冯文明

非酒精性脂肪肝疾病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种有着与酒精性脂肪肝疾病类似的肝组织学病理改变，但并非由于过量摄入酒精(男性每日30g，女性每日20g)而引起的临床病理综合征［1］。NAFLD包含的病症很广，按病程进展可以划分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎以及脂肪性肝纤维化。其中少数患者还会进一步发展成肝硬化和肝癌。在西方国家普通人群中NAFLD的发病率高达10%～24%，已成为其慢性肝病的首要病因。NAFLD的发病机制非常复杂，迄今尚未完全研究清楚。一般认为，NAFLD疾病的发生和发展可以归纳为“两次打击”或“多次打击”的分子机制模型［2］。在此模型中，由于肝内脂类代谢不平衡而引起的胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)被认为是第1次打击。胰岛素抵抗发生后，胰岛素受体通过自身磷酸化激活下游的MAPK通路以及相关的核内转录因子(如NF－κB)，促进炎症因子和活性氧自由基的释放，造成细胞内炎症反应和氧化压力的形成，进一步加重NAFLD。除此之外，激活的胰岛素受体还会通过促纤维化因子的释放刺激并激活肝星状细胞(stellate cell)，促进胶原的形成，最后造成肝的纤维化。这些由胰岛素抵抗而引起的肝内病理变化统称为第2次打击或者多次打击。在这些打击中，炎症反应既可以引起脂肪性肝炎的形成，又会进一步促进氧化压力和纤维化的进程，所以在NAFLD治疗中对炎症的抑制是非常关键的。

余甘子是大戟科叶下珠属植物余甘子(phyllanthus emblica L．)的果实，又名油柑子，滇橄榄等，是一种常用藏药。中医认为，余甘子果实味酸微涩、清热凉血、消食健脾、生津止渴。主治血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛和口干。近年实验研究证明余甘子具有丰富的药理作用，包括降低脂肪、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗肿瘤和抗菌抗炎等［3］。但是迄今为止并不清楚余甘子是否可以缓解NAFLD所引起的肝脏损伤。本研究旨在通过检测在大鼠中诱导NAFLD发生的同时注射余甘子对于肝损伤和炎症反应的抑制效果来探讨余甘子对于NAFLD的治疗作用。

材料与方法

1．材料:健康雌性SD大鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提供;余甘子萃取的简单流程为:取大约5g研磨自晾干的余甘子果实的粉末，在40℃条件下溶于100ml三蒸水中约1h。待溶液降到室温后，通过Whatman滤纸过滤，收集液体萃取物放置于避光的4℃环境备用。余甘子液体萃取物中包含约干重3．4%的抗坏血酸(维生素 C)，2．2%的单宁酸和0.7%的类黄酮;谷丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)检测试剂盒购于TECO Diagnostics公司;肿瘤坏死因子－α(TNF－α)、白介素 －1β(IL－1β)和环氧合酶 －2(COX－2)的引物设计均基于Genbank数据库并参考Primer Bank数据库。引物序列如表1所示。引物合成由宝生物工程有限公司完成。3种基因的抗体均购自于Santa Cruz公司;SV Total RNA试剂盒购自于Promega公司;SYBR ExScript RT－PCR购于Takara公司;总蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物公司。

2．方法:(1)动物模型的建立:将21只8～10周健康雌性SD大鼠置于实验室环境中以普通饲料喂养适应1周后将其分为3个研究组(n=7):对照组、NAFLD组和余甘子处理NAFLD组。其中对照组大鼠自由进食普通饲料和水。对于NAFLD组的大鼠，在其普通饲料中另加10%的猪油以及2%胆固醇后，令其自由进食饲料和水。余甘子处理NAFLD组即为在NAFLD组大鼠的饲育基础上，每日每只大鼠腹腔注射0．06ml/g余甘子萃取物。8周后所有大鼠断颈处死，将肝脏冷冻于液氮中备用，并抽取新鲜血液于5000r/min离心10min获得血清样品后冷冻备用。(2)RNA提取和反转录:大鼠肝脏组织经液氮研磨后使用SV Total RNA试剂盒提取总RNA，随后根据SYBR ExScript RT－PCR试剂盒的说明将总RNA反转录为cDNA，置于－20℃下保存。(3)荧光实时定量PCR(real－time PCR):Real－time PCR按照SYBR ExScript RT－PCR建议的体系和条件于applied biosystems prism 7900 real－time PCR机器上完成，所有引物的退火温度均优化至60℃。人类GAPDH作为内参照进行同步PCR扩增(表1)。Real－time PCR结果使用2－ΔΔCt法进行分析并以对照组百分数的形式于结果中表示。(4)免疫印迹分析(Western blotting):按照总蛋白试剂盒的方法提取肝脏组织总蛋白后使用BCA法(Bio－Rad)定量，每个样品取100μg总蛋白进行免疫印迹分析。

3．统计学方法:实验结果采用SPSS 11．0软件进行统计分析。采用方差分析，两两比较时采用SNK法，p＜0．05认为具有统计学差异。

表1 用于实时PCR检测的引物序列

结 果

1．实验前后肝脏组织学变化:SD大鼠经过8周高脂饲料的饲养后，与对照组相比，整个肝组织，尤其是肝小叶中央静脉附近出现明显的细胞坏死和炎症部位。肝内可见大量的脂肪颗粒累积。余甘子处理NAFLD组的大鼠肝脏中的细胞坏死和炎症位点明显减少，肝内脂肪颗粒的累积亦有显著改善，提示余甘子的处理可显著改善肝内由NAFLD所引起的细胞坏死、炎症反应以及脂肪累积(图1)。

图1 肝组织切片HE染色

2．血清内ALT及AST变化:ALT及AST的含量是血清中提示肝损伤的重要指标。与对照组相比，NAFLD大鼠血清中ALT和AST的表达量显著上升(P ＜0．001)，提示肝损伤的发生。加入余甘子协同处理后，大鼠血清中ALT和AST的表达量显著下降，恢复到与对照组类似的水平(表2)。

表2 余甘子对大鼠血清转氨酶的影响(U/L)

3．肝内炎症因子的变化:为了研究NAFLD发生后大鼠肝脏内炎症反应的变化，我们选取了3种炎症指示因子:TNF－α、IL－1β和COX－2来进行测定研究。定量PCR和免疫印记法的结果均表明，大鼠经NAFLD诱导后，肝内3种炎症因子的mRNA和蛋白表达水平均显著上升(p＜0．001)。经过余甘子协同处理后，与NAFLD组相比，3种因子的表达量显著下降(p＜0．01)，其中IL－1β的表达量更下降到对照水平，提示余甘子处理可以有效地从转录水平和翻译水平同时抑制肝内的炎症反应(图2)。

讨 论

本研究通过喂饲高脂饲料予雌性SD大鼠成功地建立了NAFLD模型，模拟了人类NAFLD疾病中肝脏的损伤以及炎症的发生。由于雌性大鼠比雄性大鼠更容易受到NAFLD的损伤，所以我们选择雌性大鼠作为本研究的研究对象［4］。作为一种传统藏药，萃取的余甘子溶液有效地减少了大鼠肝脏组织学上的损伤，降低了血清中ALT和AST的表达水平，亦在分子水平上抑制了肝内炎症因子的表达，显示余甘子对于治疗NAFLD的潜力。

图2 各组大鼠肝内促炎症因子的表达变化

NAFLD的发生首先是从肝内脂类代谢的平衡被打破开始的。肝脏内不断累积的脂肪颗粒会造成肝内和循环系统内游离脂肪酸的增加。游离脂肪酸和其他脂类代谢中间物会损伤肝细胞细胞器的正常功能，从而引起胰岛素抵抗、氧化压力的形成、炎症反应、肝脏纤维化以及细胞的坏死和凋亡［5］。炎症反应是NAFLD病症发展中的关键事件。由“第1次打击”胰岛素抵抗所引起的过氧化分子会引起肝脏内库普弗细胞的反应，释放出一些促炎症反应细胞因子，如TNF－α和IL－1β等，引起肝内的炎症反应，从而启动下游的促凋亡反应或者抗凋亡反应以清除肝内受到损伤的细胞。此外，肝脏炎症中释放的某些因子，如一氧化氮合成酶2(nitric oxide synthase 2，NOS2)亦能反过来通过一氧化氮通路促进更多活性氧自由基的释放，加重已有的肝内氧化压力。另一方面，激活的细胞因子(如TNF－α)还可以激活促纤维化因子的表达，使得肝内星形细胞合成胶原，造成肝内的纤维化。所以在NAFLD的治疗中，对于肝脏内炎症反应的抑制是非常重要的。在本研究中余甘子的协同处理有效地从转录水平和翻译水平抑制了3种炎症因子的表达，同时从下游组织学结果来看也显著地减少了肝组织内的坏死细胞和血液中肝损伤指示酶的水平，说明余甘子的炎症抑制效果是很明显的。但是余甘子是否还可以有效降低肝内氧化压力和纤维化的水平尚需进一步的研究。

综上所述，我们认为在大鼠NAFLD模型中，每日注射0．06ml/g余甘子萃取物可以显著减少肝组织损伤，降低肝内炎症反应，有利于NAFLD的治疗。

1 Assy N，Nasser G，Kamayse I，et al．Soft drink consumption linked with fatty liver in the absence of traditional risk factors［J］．Can JGastroenterol，2008，22(10):811 －816

2 Polyzos SA，Kountouras J，Zavos C．Nonalcoholic fatty liver disease:the pathogenetic roles of insulin resistance and adipocytokines［J］．Curr Mol Med，2009，9(3):299－314

3 成晓梅，魏屹．余甘子的研究进展［J］．安徽农业科学．2010，38(24):13094，13099

4 Sharma MR，Polavarapu R，Roseman D，et al．Transcriptional networks in a rat model for nonalcoholic fatty liver disease:a microarray analysis［J］．Exp Mol Pathol，2006，81(3):202 －210

5 Malaguarnera M，Di Rosa M，Nicoletti F，et al．Molecular mechanisms involved in NAFLD progression［J］．J Mol Med，2009，87(7):679－695