2型糖尿病的同型半胱氨酸及胱硫醚β合成酶CBS844ins68基因多态性特点

罗 丹 鄢盛恺 马红雨 程歆琦 宋耀虹

升高的血浆总同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是许多血管性疾病(如冠心病、脑卒中和进行性周围血管病)的独立危险因素，可用于独立预测心脑血管事件发生的危险性。Hcy是甲硫氨酸转甲基后生成的中间代谢产物，而前者又可在叶酸和VitB12辅助下再甲基化为甲硫氨酸或转硫基生成胱硫醚。由此可知，叶酸和VitB12是Hcy代谢中重要的辅助因子，如果二者摄入不足，可能导致血中Hcy水平升高。除了上述营养因素，Hcy还受遗传因素的影响，其代谢酶的基因突变引起的缺陷或活性下降也是导致Hcy升高的重要原因。胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)是Hcy代谢的关键酶之一。在CBS的催化下，同型半胱氨酸与丝氨酸结合生成胱硫醚。胱硫醚在γ-胱硫醚合成酶作用下裂解为半胱氨酸和α-酮丁酸。CBS缺乏或活性的降低，可导致Hcy升高。在1995年，Sebastio等发现一个同型半胱氨酸尿患者的一条等位基因的第8外显子上发生了68个碱基的插入，此插入突变复制了第7内含子受体接缝处碱基，可产生两种转录产物，其中一种含有T833C突变和一个提前出现的终止密码子，该终止子可能导致编码提前终结产生无功能的CBS酶［1］。由于不同研究对Hcy、叶酸、VitB12与糖尿病的关系的结论不一致，而且CBS844ins68基因多态性与糖尿病之间关系的报道也较少且存在很大差异，因此本实验将对糖尿病患者的Hcy水平及CBS844ins68基因多态性特点进行研究。

对象与方法

1．研究对象:共纳入155名无血缘关系的北方汉族人作为研究对象，其中72例新发糖尿病患者，选取在最近1年之内新近诊断糖尿病的患者，糖尿病的诊断标准:有典型糖尿病症状(多尿、多饮和不能解释的体重下降)者+随机血糖≥11．1mmol/L(200mg/dl)，或 FPG≥7．0mmol/L(126mg/dl)，或0GTT中2hPG≥11．1mmol/L(200mg/dl)。所有糖尿病患者均采用饮食或者药物控制血糖，未使用胰岛素治疗，无CHD病史或其他任何疾病，男性34例，女性38例，年龄56．4±5．8岁(DM组);选取83例体检中心体检证实的健康正常人作为正常对照组，男性38例，女性45例，年龄56．0±5．8岁。

2．方法:①标本采集:禁食12～14h后清晨空腹采肘静脉血，EDTA K3抗凝血3ml，抽血后立即离心分离，血浆-20℃冻存用于检测Hcy、叶酸、维生素B12;白细胞层供提取基因组DNA，用于基因多态性的检测;②标本的检测:Hcy测定采用荧光偏振免疫法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，批号为43352HN00;叶酸、维生素B12测定采用微粒子酶免分析(microparticle enzyme immunoassay，MEIA)，叶酸批号为51253M200，维生素B12批号为52380Q100。三者检测试剂盒均由雅培公司提供;③CBS844ins68多态性检测:采用根据鄢盛恺等建立的改良NaI法提取基因组DNA。检测每位受试者的CBS844ins68位点的基因多态性［2］。下列引物根据参考文献设计，正义链:5'-CTG GCC TTG AGC CCT GAA-3';反义链:5'-GGC CGG GCT CTG GAC TC-3'［3］。扩增体系包括:引物 0．4μmol/L，dNTP200μmol/L，10 × buffer 5μl，MgCl21．0mmol/L，Taq 酶 2．5U，基因组 DNA0．2μg，总体积 50μl。反应体系循环条件为94℃预变性5min，再进行以下循环:94℃1min，58℃ 1min，72℃ 1min，35 循环次，72℃ 延伸 5min。PCR产物直接进行电泳检测鉴定。

3．统计学方法:本研究中Hcy、叶酸、维生素B12为均正偏态资料，以中位数表示，经对数转换后均变为正态资料，两组计量资料的统计经转换后数据采用t检验，P值均为对数转换后的P值。两组基因型频率及等位基因频率比较采用χ2检验。以p＜0．05作为差异存在统计学意义的标准。采用SPSS 10．0软件进行统计学分析。

结 果

1．糖尿病组与对照组Hcy、叶酸、维生素B12水平的比较:DM组Hcy水平明显低于对照组(10．9μmol/L vs 12．7μmol/L，P ＜ 0．05)。DM 组叶酸水平明显高于对照组(8．3ng/ml vs 5．5ng/ml，P ＜0．05)。DM组维生素 B12水平与对照组差异无统计学意义(396pg/ml vs 431pg/ml，P ＞0．05)(表1)。

表1 糖尿病组与对照组Hcy、叶酸、维生素B12水平(中位数)的比较

2．CBS844ins68基因型判定:CBS基因PCR扩增产物目的长度为184bp。存在CBS844ins68突变者可扩增出252bpDNA片段。CBS基因扩增结果见图1。

图1 CBS844ins68扩增后不同基因型电泳结果

3．两组CBS844ins68基因型及等位基因频率分布:两组基因型频率及等位基因频率之间差异均无统计学意义(P均＞0．05)。两组均未发现纯合突变，且杂合频率均较低。对照组CBS844ins68杂合频率6．0%，糖尿病组 1．4%(表 2)。

表2 两组CBS 844ins68基因型及等位基因频率的比较

讨 论

国内外对Hcy与糖尿病之间的关系报道不完全一致。周灵丽等研究表明糖尿病患者Hcy与正常对照组比较差异无显著意义，与本研究结论不一致，可能与病例选取范围有关，其研究的糖尿病患者范围较广，并没有具体区分单纯糖尿病组或糖尿病并发症组［4］。陈先荣等［5，6］研究表明 2 型糖尿病的患者 Hcy浓度明显高于对照组，亦与本研究结论不一致，原因可能在于除了病例选取范围比较广，而且患者年龄范围亦比较广(49～85岁)，另有研究表明Hcy与年龄具有显著相关性，Hcy随着年龄增加而增加，如果研究中患者年龄偏高也可能导致结果偏高。黄宁等［7］研究表明糖尿病无并发症患者Hcy与正常对照组比较差异无显著意义，与本研究结论亦不一致，可能由于其研究中无并发症的糖尿病患者的病程较长均超过5年，而本研究均为最近1年之内新近诊断糖尿病的患者。Al-Nozah等［8］研究与本研究结论一致。本研究糖尿病组Hcy水平明显低于正常对照组，可能由于选取的对象为新发糖尿病患者，无任何其他疾病或并发症。本研究中糖尿病组叶酸水平比正常对照组显著升高，可能与新发糖尿病的Hcy减低有关，前面的研究表明Hcy与叶酸水平显著负相关［6］。

新发糖尿病Hcy减低的机制，不是十分清楚，可能与转硫酶活性增强有关。一研究报道糖尿病鼠的Hcy水平明显减低，肝脏的转硫酶活性增强，经胰岛素治疗可使酶活性恢复正常从而调节Hcy的代谢［9］;另一项研究报道，糖尿病鼠的Hcy水平也明显减低，肝脏的甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)和CBS活性及其mRNA均增加［10］。

然而糖尿病随着病程的增加，Hcy有可能因为肾脏功能损伤而增加。肾脏是Hcy代谢与清除的主要场所，含有Hcy再甲基化和转硫基的多种酶系，约70%的Hcy从肾脏排泄。糖尿病患者随着年龄增加，肾脏甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶、胱硫醚合成酶、γ-胱硫醚酶等活性降低，肾小球滤过功能下降，被肾小管重吸收的Hcy在肾实质上皮细胞中的代谢减少，这些均会导致Hcy增加［11］。Hcy水平可能与糖尿病患者肾单位损伤的比例、肾脏损伤的进展程度以及胰岛素抵抗等各种因素有关［12］。2型糖尿病患者个体在病程进展的不同阶段，Hcy水平会发生变化，可以有不同表现。由此可见，不同的糖尿病研究的Hcy水平的结论不一致可能与病例选取中是否患有并发症、病例的年龄、糖尿病的病程时间长短等因素均有关。

增加的Hcy可促进糖尿病冠心病以及糖尿病微血管病变的发生，其引起机体损伤的机制还不十分清楚，可能与以下因素有关:①氧化应激损伤;②诱导平滑肌细胞增殖;③糖尿病患者的LDL比非糖尿病患者的LDL更易发生同型半胱氨酸化，引起内皮细胞的毒性作用;④晚期糖基化终产物可能协同Hcy通过氧化应激途径导致内皮损伤，加速动脉粥样硬化的发展等［13～18］。

CBS 844ins 68的基因多态性进行分析的基本原理:CBS基因的8号外显子的一个68bp的插入突变(CBS 844ins 68)导致了CBS基因多态性的产生，对不同个体的基因进行CBS844ins 68基因扩增，根据是否因插入突变从而得到不同长度的扩增片段，以此区分不同的基因型。Sebastio等认为此基因多态性产生了提前终止的密码子，从而产生无功能的CBS酶［1］。不同的CBS基因型可能导致不同个体CBS的表达与功能上的差异，从而导致不同的生物学效应，因此此基因型可能作为基因背景，导致不同人群对于疾病具有不同的基因易感性以及不同的临床特征。

本研究中两组之间CBS844ins68基因型频率及等位基因频率的差异无统计学意义。两组杂合频率均较低，且均未发现纯合突变。Tsai等报道CBS844ins68在美国正常人中杂合子较常见，频率约为11．7%［3］。国内研究结果显示正常对照组的CBS844ins68bp杂合子频率为5．0%，与本研究结果类似。本研究与国外研究存在差异，可能与地域、遗传、种族等因素有关。Sebastio等推测由于CBS844插入产生提前出现的终止密码子，导致产生缩短的蛋白质即无功能的 CBS 酶［1］。而 Tsai等［3］报道CBS844ins68插入并没有导致同型半胱氨酸血症。Summers等研究亦表明 CBS844ins68可使 MTHFR 677TT者的Hcy与叶酸水平趋向正常。不同研究对CBS844ins68功能结论不一致，有待扩大样本量、选取特定人群进一步研究证实。

本研究结果表明新发2型糖尿病患者Hcy水平可能减低，但也应监测Hcy水平，防止Hcy可能在不同病程对患者造成的损伤，进一步的研究应区分不同病程，不同年龄，根据不同Hcy水平，进行补充叶酸或维生素等试验，对糖尿病患者进行个体化治疗，尽量减少高Hcy血症对糖尿病患者的损伤防止并发症的发生。CBS844ins68基因多态性可能与中国北方汉族人糖尿病无关。

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7 黄宁，刘伟，毕正．2型糖尿病患者血浆同型半胱氨酸的水平变化及临床意义［J］．河北医药，2009，31(20):2758-2759

8 Al-Nozah M，Al-Daghri N，Bartlett WA，et al．Serum homocysteine concentration is related to diabetes mellitus，but not to coronary heart disease，in Saudi Arabians［J］．Diabetes Obes Metab，2002，4(2):118-123

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10 Wijekoon EP，Hall B，Ratnam S，et al．Homocysteine metabolism in ZDF(Type 2)diabetic rats［J］．Diabetes，2005，54(11):3245-3251

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