CXCR4和MMP－9在胃癌组织中表达及其与淋巴结转移的关系

徐 斌 韩绍伟 周笑珍 李立义 蒋 平

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均居我国消化道恶性肿瘤的首位。复发和转移是胃癌死亡最主要的原因，其中淋巴转移是其最常见的转移方式之一，但分子生物学机制仍不十分明确。研究发现淋巴结转移是胃癌患者预后的独立危险因素，对肿瘤分期和治疗有重要意义［1］。CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)是趋化因子家族重要成员，通过与其配体CXCLl2间的相互作用在包括胃癌在内的多种肿瘤的发生、进展和转移中发挥着重要的作用［2］。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)是一种能降解细胞外基膜及其他细胞外基质成分的重要蛋白酶，具有促进肿瘤浸润和转移的作用。胃癌组织中CXCR4与MMP－9表达与淋巴转移的关系及其相关性目前尚鲜见报道。本研究应用(RT－PCR)及S－P免疫组化方法检测CXCR4和MMP－9在30例无淋巴转移与46例有淋巴转移人胃癌组织中的表达水平，并探讨CXCR4和MMP－9的表达及与胃癌淋巴结转移的关系及两者相关性。

材料与方法

1．材料:76例胃癌组织标本取自2009年12月～2010年12月在笔者医院普外科行手术切除术患者，其中男性52例，女性24例，患者年龄26～79(57．0±1．8)岁，术前均未行放化疗，所有病例术前病例学证实为胃癌。肿瘤分期按照2002年国际抗癌联盟(U1CC)颁布的胃癌TNM分期方案:PN030例，PN135例，PN26例，PN35例。每份标本于术后10min内取材于肿瘤组织，正常组织(距肿瘤组织边缘＞5cm，做正常对照)。全部标本取材后迅速分成两份，分别置于10%中性甲醛中固定和－80℃冰箱保存，备用。

2．试剂:鼠抗人CXCR4抗体购至美国Sigma公司，兔抗人MMP－9抗体购自美国Epitomics公司，免疫组化S－P试剂盒购自德国宝灵曼公司。CXCR4，MMP－9引物由北京奥科生物技术公司设计。总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购于美国Gibico BRL公司。

3．方法:(1)S－P法进行免疫组织化学染色法检测CXCR4和MMP－9蛋白表达:组织切片脱、蜡脱水及双氧水室温孵育后，组织抗原修复10min(用pH 6．0的0．01mol/L柠檬酸缓冲液，于微波炉中94℃加热，每次5min，共2次)，滴加一抗和二抗。DAB显色，显微镜下控制染色程度。操作过程中严格质控。用已知阳性的胃癌切片作为阳性对照，用PBS代替一抗，作为阴性对照。(2)免疫组织化学结果判断:CXCR4和MMP－9均为胞膜或胞质表达，以细胞膜和(或)细胞质呈棕黄或棕褐色者为阳性细胞，随机计数10个高倍视野(×400)，每个视野读取200个细胞计数阳性细胞数，计算阳性率，并取平均值。所有切片均用盲法计数。阳性表达判断参照Mattern等［3］的计数方法。(3)反转录－聚合酶链反应(RT－PCR)检测CXCR4mRNA和MMP－9mRNA表达:胃癌标本从－80℃冰箱内取出后，迅速置于研钵中，在液氮中研磨为粉末状，按试剂盒操作说明提前总RNA。取2μg总RNA，用MMLV反转录酶试剂盒(GIBGO－BRL)合成cDNA，以3－磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内对照。扩增引物为:CXCR4前向引物5'－AAGAAACTGAGAAGCATGACC－3'，后向引物 5'－GAAACTGGAACACAACCACC－3'，扩增片段大小为406bp。MMP－9前向引物5'－TCAGGGAGACGCCCATTT－3'，后向引物5'－TCGGGCAGAAGCCGAAG－3'，扩增片段大小为398bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统成像，并确定条带光密度值。

4．统计学方法:应用SPSS15．0统计软件对实验数据进行分析。采用Fisher确切概率法分析MMP－9和CXCR4表达与淋巴结转移的相关性;MMP－9与CXCR4相关性检验采用Spearman等级相关分析。p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．CXCR4和MMP－9蛋白在胃癌组织中的表达:CXCR4在癌旁正常胃组织中无阳性表达，在pN0组胃癌组织中阳性表达率26．67%(8/30)。MMP－9在癌旁正常胃组织阳性表达率为15．79%(12/76)，在pN0组胃癌组织中阳性表达率46．67%(14/30)，差异有统计学意义(p＜0．05)。依据2002年国际抗癌联盟(U1CC)颁布的胃癌TNM分期，pN0胃癌组织中CXCR4和 MMP－9的阳性表达率(15．79%和46.67%)与 pN1组(65．71%和 74．29%)差异有统计学意义(χ2=9.873，P=0.002 和 χ2=5.206，P=0.023);且显著低于pN2+pN3组，差异有统计学意义(p＜0．05)(MMP－9阳性表达在pN1和pN2+pN3间差异无统计学意义，P=0．061)。pN2组，pN3组CXCR4和MMP－9在胃癌组织中的阳性表达率分别为，差异无统计学意义(P＞0．05)。各组肿瘤组织切片经PBS代替特异性一抗作为空白对照，肿瘤组织镜下均无阳性表达。见图1、图2、表1。

表1 CXCR4和MMP－9在不同淋巴结转移胃癌组织中的表达

2．CXCR4mRNA和MMP－9mRNA在胃癌组织中的表达:如图 3所示，MMP－9mRNA和 CXCR4mRNA在胃癌组织中的表达随淋巴转移增加而表达明显上调。

图3 CXCR4和MMP－9的表达与淋巴转移关系

3．经Spearman等级相关分析:胃癌组织CXCR4的阳性表达水平与MMP－9的阳性表达水平呈正相关(r=0．406，P ＜0．01)，见表 2。

表2 胃癌中CXCR4与MMP－9表达的关系

讨 论

淋巴结转移是影响胃癌患者根治术后生存率的最重要因素之一，并且淋巴管浸润是独立的死亡危险因素之一，其中MLR与胃癌患者术后生存时间存在直线关系［4］。因此早期发现及阻断胃癌淋巴结转移，从而提高患者预后值得我们进一步研究。

CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor4，CXCR4)是一个编码352个氨基酸且高度保守的G蛋白偶联7次跨膜受体，与其特异性配体CXCLl2所构成的CXCL12/CXCR4生物学轴(CXCL12/CXCR4 biological axis)在多种肿瘤的侵袭与转移中发挥重要作用［5］。恶性肿瘤细胞高表达趋化因子受体 CXCR4，并可能在CXCL12趋化、牵引下致使肿瘤细胞转移至作为配体产生源的某些器官(如肺、骨、肝、肾、淋巴结等)，从而形成器官特异性的转移［6］。Kato等［7］研究发现CXCR4与乳腺癌的侵袭及转移相关，并且可能促进乳腺癌的淋巴转移。有研究证明CXCR4促进子宫颈癌向盆腔淋巴结组织转移［8］。本实验中，免疫组织化学法检查结果显示，CXCR4阳性在伴有淋巴结转移的胃癌组织中阳性表达率为73.91%，明显高于无转移者(36．37%)，并且在pN2+pN3组表达明显高于pN1组，差异有统计学意义(p＜0．05)。笔者还发现，随淋巴结转移增加 CXCR4 mRNA表达明显上调(p＜0．05)。以上结果提示趋化因子受体CXCR4的表达可能促进胃癌的淋巴结转移，其可能机制为胃癌组织高表达CXCR4与淋巴结选择性高表达CXCR4特异性配体CXCL12，从而促进肿瘤的淋巴转移。另外，Iwanaga等发现，表达CXCR4的人胃癌裸鼠模型经CXCR4拮抗剂AMD3100治疗后的，肿瘤容积较对照组减小27．6%，且未见明显的毒性症状。因此，阻断CXCR4蛋白信号途径可能是治疗胃癌及其转移的有效策略。

MMP－9(基质金属蛋白酶－9)是MMP－s(基质金属蛋白酶)家族的重要成员之一，在多种肿瘤的发生、发展中起重要作用。激活状态的MMP－9调节ECM的降解过程，水解细胞基膜及外基质中的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和凝胶、弹力蛋白成分，导致基膜破坏，肿瘤细胞浸润结缔组织基质，侵入小血管和淋巴管而发生转移。最近发现，MMP－9在胃黏膜的表达是胃癌发生的晚期事件，是胃黏膜上皮细胞发生恶变的标志，其过度表达对胃癌的发生，发展起重要作用［9］。本实验中，免疫组化结果显示，MMP－9在人胃癌组织的阳性表达率明显高于正常胃组织(p＜0．05)，伴有淋巴结转移者高于无转移组(p＜0．05)。本实验还发现，随淋巴结转移增加MMP－9 mRNA表达明显上调(p＜0．05)。说明MMP－9与胃癌的发生及淋巴结转移有关，且MMP－9高表达的胃癌组织具有较强的淋巴管侵袭及淋巴结转移能力;MMP－9可作为评估胃癌恶性程度的及淋巴结转移情况的一个指标。

分析CXCR4和MMP－9的表达与胃癌淋巴转移的关系发现，伴有淋巴转移的胃癌组织的CXCR4和MMP－9的阳性表达明显高于无转移者，随着胃癌淋巴转移的分期增加，CXCR4和MMP－9的表达相应上调。在CXCR4表达上调的胃癌组织，MMP－9表达亦相应上调。以上结果提示CXCR4和MMP－9的高表达可能是胃癌淋巴转移的重要分子标志。两者在介导胃癌的淋巴转移间具有协同效应，然而关于两者在介导胃癌淋巴转移的具体机制的研究未见报道。进一步研究CXCR4和MMP－9在胃癌淋巴转移中的相互作用及其机制，有助于进一步阐明胃癌淋巴转移的具体机制，可能为评估胃癌的淋巴转移情况提供分子标志物，并为进一步治疗和预防胃癌的淋巴转移提供实验数据和理论基础。

综上所述，本研究表明CXCR4和MMP－9的表达与胃癌的淋巴结转移显著相关，并随淋巴转移的分期增加其阳性表达明显上调，而且两者之间存在协同效应。因此笔者推测，CXCR4和MMP－9可能共同介导胃癌的淋巴转移。但其具体机制尚未明确，有待进一步研究。

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2 Balkwill F．The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4［J］．Semin Cancer Biol，2004，14:171 －179

3 Mattern J，Koomagi R，Volm M．Associalion of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel densilv and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma［J］．Br JCancer，1996，73(7):931 －934

4 吴巨钢，倪晓春，俞继卫，等．胃癌淋巴结转移率和预后的关系［J］．中华胃肠外科杂志，2009，12(2):202 －203

5 吕明，赵文华．CXCL12－CXCR4生物学轴在肿瘤侵袭与转移中的研究进展［J］．国际肿瘤学杂志，2008，35(2):90 －92

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7 Kato M，Kitayama J，Kazama S，et al．Expression pattern of CXC chemokine receptor－4 is correlated with lymph node metastasis in human invasive ductal carcinoma ［J］．Breast Cancer Res，2003，5(5):R144－R150

8 苏一乐，宋静慧，吉亚南．子宫颈癌和盆腔淋巴结组织中趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12基因DNA的表达及其意义［J］．中华妇产科杂志，2006，41(10):717－719

9 姬瑞，周永宁，任涛文，等．MMP－9在胃癌及其淋巴结组织中表达的临床意义［J］．中国肿瘤临床，2010，37(7):377－380