菊米提取液对人胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响

司马军 金晨宇 方迪龙 金哲柱 郑鸣之

菊米多为菊科植物甘野菊(chrysanthemum seticuspe)的花蕾制作而成。据《增广本草纲目》记载，菊米为处州一种山中野菊，土人采其蕾(蕊)干之，如半粒绿豆大，甚香且清圆黄亮。目前被广泛用于保健茶饮。经研究发现菊米富含挥发油、蛋白质、菊米内脂、野菊花素、黄酮等营养成分，也含有小白菊内酯、木犀草素、芹菜素、萜类化合物等成分。已有研究证实［1～5］，菊米提取液可通过影响 NO 途径，增加 NOS活性和内皮细胞超极化因子(EDHF)释放，发挥舒张血管、对抗实验性心律失常和心肌缺血再灌注损伤等作用;小白菊内酯可抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖;萜类化合物可诱导人肝癌SMMC－7721细胞凋亡;木犀草素、芹菜素等可通过抗增殖和诱导凋亡抑制恶性肿瘤细胞的增长［6，7］。故推测，菊米提取液可能对肿瘤细胞生长产生影响，为此笔者将不同浓度的菊米提取液与人胃癌细胞AGS共同培养，观察其对AGS细胞增殖和凋亡的影响。

材料与方法

1．材料:人胃癌细胞AGS购自中科院上海细胞库，野菊米购自遂昌华昊菊米有限公司，DMEM(dulbeccos modified eagle medium)细胞培养液购自 Gibco公司，噻唑蓝(thiazole blue，MTT)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)及二甲基亚砜(DMSO)均购自 Sigma公司，casapase－3/7、casapase－6活性检测试剂盒购于Promega公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司。菊米提取液的制备:取干的野菊米加入10倍的无水乙醇室温萃取24h，过滤去沉淀，上清液用旋转蒸发器浓缩即可。

2．MTT法测定细胞生存率:用含2%FBS(fetal bovine serum)的DMEM培养液调整细胞浓度至3×104个/毫升，按180微升/孔(6×103个左右细胞量)接种于96孔板中，16h后给予各种不同处理并于37℃、5%CO2条件下继续培养48h。然后各孔中按1∶9加入5mg/ml MTT(用 pH 7．4 PBS配制)，再置37℃、5%CO2条件下继续培养4 h。弃去上清液，加入DMSO 150微升/孔，摇床30min后，在酶联检测仪上570nm波长处测吸光度(A)值，以A值间接反映存活细胞数量，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1－A给药/A对照)×100%。

3．细胞凋亡测定:采用PI单染分析法用流式细胞仪测定细胞周期以反映细胞凋亡情况。收集各处理组细胞均匀打散，PBS(phosphate buffer saline)冲洗3次后于70%乙醇中4℃固定18h，洗去乙醇，加入RNase(50mg/ml)消化并用PI(100mg/ml)染色30min，用流式细胞仪检测细胞亚二倍体凋亡峰，根据此亚二倍体峰计算凋亡细胞的百分率。

4．caspase－3/7，caspase－6活性分析:具体操作根据 Promega试剂盒说明书，即将细胞均匀接种于96孔板中，给予不同处理后，各孔加入与培养基等体积的caspase－3/7，caspase－6发光底物(分别为Z－DEVD－R110，Z－VEID－氨基萤光素)，轻轻摇匀30s，室温孵育3h后于多功能荧光分析仪Wallac 1420 Explorer上测量萤光值(relative light units，RLU)。

结 果

1．菊米提取液对AGS细胞增殖的影响:随药物质量浓度0．001～0．010mg/ml增加，细胞的增殖抑制率逐渐上升，且与菊米提取液质量浓度呈正相关(r=0．905，P ＜0．05)，0．01mg/ml时对细胞增殖的抑制作用最大，达到(58．32 ±2．68)%(图1)。

2．菊米提取液对AGS细胞凋亡的影响:AGS细胞与含有菊米提取液0.001～0．010mg/ml的完全培养基或不含药的完全培养基共同培养48h后，收集全部培养细胞经流式细胞术检测，不含药的对照组细胞凋亡发生率为(1．77±0．60)%，含菊米提取液0.001、0．002、0．005、0．010mg/ml的药物组细胞凋亡率分别为(4．63 ± 1．45)%、(11．03 ± 2．01)%、(15.53 ±1．96)%及(23．77 ±1．65)%。与对照组相比，除了0．001mg/ml药物浓度组，其余3个药物浓度组均显著提高了细胞凋亡率(p＜0．05)，且呈现一定的剂量依赖性(图2)。

3．菊米提取液对 caspase－3/7、caspase－6酶活性的影响:AGS细胞与含有菊米提取液 0．001～0.01mg/ml的完全培养基或不含药的完全培养基共同培养48h后，与对照组相比，除了0．001mg/ml药物浓度组，其余 3个药物浓度组的 caspase－3/7、caspase－6酶活性均有显著增加(p＜0．05)，且呈现一定的剂量依赖性(图3)。

讨 论

诱导和促进肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的重要策略之一［8］。临床上常用的化疗药物多具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但不良反应较大，也易产生耐药性。因此，从天然植物中获取不良反应小、不易产生耐药性的抗癌新药越来越受到人们的重视。

本实验研究发现，菊米提取液在体外能明显抑制胃癌细胞AGS生长，而且这种作用出现一定的浓度依赖性。菊米提取液对胃癌AGS细胞的增殖抑制率随着浓度的增加而增加(P ＜0．05)，在4．713×10－3mg/ml可使半数细胞生长受抑制，这可能与其诱导细胞凋亡有关。流式细胞术检测菊米提取液对AGS细胞凋亡的影响，结果显示，菊米提取液可随着浓度的增加而增大细胞凋亡率，0．01mg/ml的菊米提取液处理AGS细胞48h后，其细胞凋亡率为对照组的13．5倍。在对AGS细胞caspase－3/7酶及caspase－6酶活性的检测实验中证实了菊米提取液可通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的生长。

图3 菊米提取液对胃癌AGS细胞caspase－3/7、caspase－6酶活性的影响

细胞凋亡是基因控制的细胞自主性死亡过程，它是在基因调控下的一个严密完整的程序过程。其中caspase家族在凋亡过程中起到关键性的作用，能引起细胞在形态和生物学特性的改变。caspase－3、caspase－7与caspase－6是主要的处于细胞凋亡下游的凋亡效应分子。caspase－3被称为“死亡蛋白酶”，是细胞凋亡的生物学标志，其活化及活性受到多种因素的调节。已有研究表明，caspase－7与caspase－3在诱导肿瘤细胞凋亡的过程存在正相关，但在细胞凋亡级联反应中 caspase－7究竟位于caspase－3 的下游，还是平行关系，意见不一［9］。caspase－6参与细胞凋亡的执行并可降低凋亡信号诱导细胞死亡的阈值，其与caspase－3二者有38%同源性，二者是不同凋亡途径共同的下游路径，但二者的调控机制及相互关系并不十分明确。有研究发现，caspase－3蛋白早于caspase－6蛋白的激活，并与caspase－6蛋白的活化有密切关系，活化的caspase－6蛋白反过来又能活化caspase－3蛋白，形成对caspase－3蛋白活化的正性循环。本实验显示，随着菊米提取液浓度的增加，用荧光底物检测法观察到caspase－3/7酶和caspase－6酶活性的改变呈剂量依赖性增高，0．01mg/ml的菊米提取液处理AGS细胞48h，其酶活性分别为对照组的4．3倍和2．0倍。提示caspase－3/7基因和caspase－6蛋白基因的蛋白翻译水平同样可能是菊米提取液的作用位点，菊米提取液可能通过增加caspase－3/7、caspase－6蛋白表达、活化而促进细胞凋亡。有关caspase家族在细胞凋亡过程中的相互作用机制，还有待今后进一步的深入研究。

自由基导致DNA损伤且抑制损伤后的修复，是自由基诱导细胞癌变的主要原因。以往的研究结果显示，菊米提取液可通过增加内皮细胞内的一氧化碳合酶(nitric oxide synthase，NOS)，使NO生成增加而发挥舒张血管的作用，该结果提示菊米提取液具有抗氧化的作用［2］。因此，菊米提取液的抗氧化能力也可能是其抗肿瘤的机制之一，这有待进一步深入研究。

目前关于菊米提取液抗胃癌机制的相关研究还不多。本研究显示，菊米提取液能诱导胃癌细胞系AGS凋亡，抑制其增殖。为菊米提取液今后用于临床治疗胃癌提供一定的理论基础。

1 徐策，叶挺梅，朱立，等．菊米提取液抗实验性心律失常作用的研究［J］．中国应用生理学杂志，2007，23(4):399－402

2 叶挺梅，徐和靖，汪洋，等．菊米提取液舒张血管作用及其机制研究［J］．中国病理生理杂志，2007，23(4):644－647

3 叶挺梅，陈文良，朱立，等．菊米提取液对抗心肌再灌住损伤［J］．中国病理生理杂志，2008，24(12):2328－2332

4 翁少翔，单江，徐耕，等．小白菊内酯抑制胎牛血清诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及信号转导机理［J］．中国药理学与毒理学杂志，2002;16(5):331－335

5 张琪，王勤，苗瑞东，等．盘花垂头菊中两种新型倍半萜类化合物抑制人肝癌 SMMC－7721细胞生长［J］．药学学报，2002，37(12):993－995

6 张芳芳，沈汉明，朱心强．木犀草素抗肿瘤研究作用的进展［J］．浙江大学学报:医学版，2006，35(5):573－578

7 胡太平，曹建国．芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究［J］．国际病理科学与临床杂志，2007，27(1):6－11

8 Gazitt Y，Akay C．Arsenic trioxide:An anticancer missile with multiple warheads［J］．Hematology，2005，10(3):205 － 213

9 胡会华，周士福，李青国．新辅助化疗中凋亡效应因子caspase－7、caspase－3及凋亡抑制因子survivin关系初探［J］．中国综合临床，2007，23(10):896－898