角鲨烯合成酶抑制剂的高通量虚拟筛选

詹冬玲, 韩葳葳, 刘景圣

(1. 吉林农业大学 食品科学与工程学院, 长春 130118； 2. 吉林大学 分子酶学工程教育部重点实验室, 长春 130012)

角鲨烯合成酶(SQS)是人体内胆固醇合成、 代谢中的一种重要酶, 它能催化两分子法呢基二磷酸(FPP), 经还原性二聚作用, 产生中间体前角鲨烯二磷酸. 在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的还原作用下, 前角鲨烯二磷酸生成角鲨烯, 再经进一步反应生成胆固醇[1-2]. 因此, 抑制SQS的活性, 就能减少角鲨烯的生成量, 从而降低胆固醇水平; 同时角鲨烯合成酶的催化反应在合成类异戊二烯的分支途径后, 所以SQS抑制剂对类异戊二烯的合成没有影响. 因此, SQS已成为治疗高脂血症和冠状动脉心脏病的作用靶点, 其抑制剂的研究已成为降血脂药物研制的重要方向[3]. 目前已研发的SQS小分子抑制剂均存在不同程度的毒副作用, 因此有待于进一步的化学修饰. 计算机辅助药物设计依据对分子理化性质如分子极性、 所带电荷、水溶性和分配系数等参数的计算分析, 可以在计算机上方便、 快捷地建造、 分析和修改分子结构, 并利用三维技术实时显示其立体结构, 推算出各种低能构象, 进行构象分析并与酶模型相结合, 对药物分子进行定量设计. 根据软药原理对先导化合物进行结构改造, 先获得候选化合物, 再通过系统软件对分子的理化参数进行分析, 确立筛选依据, 可获得安全有效的药物分子.

本文以角鲨烯合成酶(SQS)[4](PDB code 1EZF)的一种抑制剂N-{2-[反-7-氯-1-(2,2-二甲丙基)-5-萘亚甲基-2-氧代-1,2,3,5-四氢苯并1,4-氧杂吖庚因]-乙酰}-天门冬氨酸(CP-320473)结构作为先导化合物, 使用AutoDock Vina软件[5]进行高通量虚拟筛选, 以寻找高效低毒的新抑制剂化合物.

1 理论方法

先以CP-320473为先导化合物在zinc数据库中(http://zinc.docking.org/index.shtml)搜索小分子配体衍生物, 然后用AutoDock Vina软件[5-6]对这些化合物进行虚拟筛选. 用AutoDock Vina软件进行分子对接, 利用其grid box把网格的间隔设为1, 最后得到能量得分最低的小分子. 选取能量最低的化合物(zinc_8442249), 用Gaussian03PM3方法将其进行结构优化[7-8].

Affinity[9]是商业的半柔性分子对接程序, 在对接过程中, 底物与设定的酶部分残基可以移动, 酶的其他部分则固定不动. 在Monte Carlo构象搜寻步骤中, 将默认的100步最小化提高到1 000步, 每个搜寻到的构象会在298 K的恒温条件下做1 000 ps的分子动力学模拟后再进行能量最小化. 在最终得到的10个最优构象中, 选取能量最低的构象作为进一步分子对接研究的对象.

本文采用Ludi打分系统, 其特点是以蛋白质三维结构为基础, 通过化合物片段自动生长的方法产生候选药物的先导化合物. Ludi打分可以评估受体和配体的结合强弱.

2 结果与讨论

2.1 高通量虚拟筛选

角鲨烯合成酶具有完全的α螺旋构象, 螺旋分3层, 结构如图1所示. 由图1可见, 整个蛋白只有一个结构域, 中间有个通道凹槽, 而CP-320473位于凹槽中间.

以CP-320473为先导化合物, 采用60%的结构相似度, 通过建立的筛选策略进行筛选, 从zinc数据库的1 300多万小分子中筛选出100个小分子, 使用AutoDock Vina软件对这100个小分子分别与角鲨烯合成酶进行分子对接. 最终得到能量得分处于前8位的小分子, 结果列于表1. 筛选出来的8种小分子与SQS酶复合物的对接如图2所示; 筛选出来8种小分子抑制剂的结构如图3所示.

表1 配体对接得分排名Table 1 A ranked score of docked ligands

综上所述, 选择能量得分最低的小分子抑制剂zinc_8442249(分子式为C30H30ON2), 对其进一步研究.

2.2 分子对接

先通过Binding-Site模块进行抑制剂部位的搜索, 结合已知的实验数据, 预测SQS抑制剂结合位点的残基, 包括Thr50-Phe54和Tyr73; 再用Gaussian03 PM3方法对CP-320473和新抑制剂zinc_8442249进行结构优化; 最后用Affinity软件对接. 表2列出了这两种抑制剂与酶的相互作用能. 由表2可见, CP-320473与酶的相互作用能(-57.53 kJ/mol)比zinc_8442249与酶的相互作用能(-163.65 kJ/mol)高, 表明后者与酶形成的复合物更稳定, 不易脱去, 能更好地抢占空间, 抑制酶的催化反应发生. Ludi的得分(CP-320473: 499; zinc_8442249: 751)也说明zinc_8442249是更好的抑制剂.

表2 抑制剂与SQS对接的总能量、 范德华力、 静电作用力和Ludi得分Table 2 Total energy(Etotal), van der Waal energy(Evdw) and electrostatic(Eele) between inhibitors and SQS with Ludi score

图1 CP-320473-SQS复合物Fig.1 CP-320473-SQS complex

图2 8种抑制剂-SQS复合物Fig.2 Eight docked inhibitor-SQS complexes

图3 8种抑制剂的3D结构Fig.3 3D structure of eight inhibitors

氢键对分子的结构和功能, 尤其是酶与抑制剂的结合过程具有重要作用. 图4为SQS活性位点的部分残基与zinc_8442249的作用结果. 由图4可见, zinc_8442249羟基上的氧与K52的咪唑部分形成2个氢键, 因此K52具有稳定zinc_8442249的作用. K52残基位于凹槽的中心部位, 是高度保守的, 因此在SQS中具有稳定抑制剂的作用.

图4 zinc_8442249与SQS间的氢键Fig.4 Hydrogen bond between zinc_8442249 and SQS

分子间的非键相互作用对于确定抑制剂与酶之间的相对位置以及关键残基非常重要, 由于SQS的口袋较大, 涉及的氨基酸残基较多, 与zinc_8442249之间的总相互作用能小于-3 kJ/mol的残基及其相互作用能列于表3. 由表3可见, Lys52与SQS形成氢键的残基相互作用能特别是静电相互作用较大. Pandit等[4]认为, SQS的中心凹槽埋于里面, 只有一个瓣状的尾部露在外面, 周围都是疏水的残基. 由表3可见, Ser51,Ser53,Phe54和SQS残基的静电相互作用很大, 计算结果与实验相符. Phe73,Arg77,Ile215,Arg218,Ala57,Val58也与抑制剂有较大的静电相互作用； Tyr179,Leu211,Pro292,Leu183,Phe288与抑制剂的相互作用主要是库仑力.

综上所述, 从氢键和相互作用能两方面看, SQS活性位点的Lys52对抑制剂zinc_8442249都具有重要作用.

表3 H-89-1与SQS部分位点氨基酸残基的作用总能量、 范德华力和静电作用力Table 3 Total energy(Etotal), van der Waal energy(Evdw) and electrostatic (Eele) between H-89-1 and each of individual residues of SQS

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