翻转肠囊法研究芒果苷在大鼠的肠吸收动力学

陈宝婷，徐福平，林爱华，刘奕明

(广州中医药大学，广东省中医院中心实验室，广东广州 510120)

芒果苷(mangiferin)是常用中药知母的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、免疫调节、神经保护、抗炎、退热、镇痛和抗寄生虫等活性［1－3］。为深入探讨芒果苷的肠吸收特性及与 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的关系，本文采用大鼠肠外翻模型，研究不同肠段、不同中药环境(知母水煎液、知母-黄柏水煎液)以及P-gp抑制剂对芒果苷肠吸收的影响，为阐明芒果苷的肠吸收动力学机制，理解药对知母黄柏的作用基础，指导临床遣方用药和提高临床疗效提供实验依据。

1 材料

1.1 药品与试剂 芒果苷对照品(纯度98%，天津市河北区双吉色谱仪经营部);盐酸维拉帕米注射液(verapamil，Ver，上海禾丰制药有限公司，Lot:100501);环 孢 素 A(cycloporineA，CsA，Lot:040842HB);实验用黄柏(Lot:090705661)、知母(Lot:090705211)，均购自广东康美药业股份有限公司;乙腈，HPLC级，Fisher公司;磷酸为色谱纯。Krebs-Ringer试剂(K 氏液:NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，glucose 1.4 g，加纯水定容至1 000 ml)。

1.2 仪器 美国WATERS超高效液相色谱(UPLC)系统;台式高速离心机(美国贝克曼库尔特公司);德国IKA MS1型涡旋混匀器;恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司);十万分之一电子天平(Mettler Toledo，AB135-S 型)。

1.3 实验动物 SD♂大鼠，体质量(250±20)g，广东省医学实验动物中心提供，合格证号:SCKX(粤)0073276。

2 方法

2.1 供试液配制 芒果苷供试液:精密称取芒果苷对照品20 mg，加适量二甲基亚砜(DMSO)超声振荡溶解，移至1 L容量瓶中，加K氏液定容，配制成浓度为20 mg·L－1的芒果苷供试液(DMSO终浓度＜0.1%)。

知母、知母-黄柏供试液:称取知母15 g置于2 L圆底烧瓶中，加纯水浸泡30 min后加热回流提取3 次，每次1 h，3 次加水量分别为 500、300、300 ml，过滤，合并3次滤液，UPLC法测定芒果苷浓度［4］，以K氏液稀释得到芒果苷浓度为20 mg·L－1的知母供试液。称取知母15 g、黄柏15 g，按上述操作配制芒果苷浓度为20 mg·L－1的知母－黄柏供试液。

含Ver或CsA的芒果苷供试液:精密称取芒果苷对照品10 mg，以少量DMSO振荡溶解，分别加入Ver或CsA，以K氏液配成质量浓度为芒果苷20 mg·L－1，Ver或 CsA 100 mg·L－1的供试液。

2.2 芒果苷浓度测定方法 采用UPLC法测定芒果苷。色谱条件:WATERS ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(2.1 mm× 50 mm，1.7 μm);流动相为0.1%磷酸-乙腈，梯度洗脱(乙腈:0 min为5%，5.5 min为18%);流速0.25 ml·min－1;检测波长260 nm;柱温 35℃;进样量 5 μl。

2.3 大鼠翻转肠囊实验 采用翻转肠囊法［5］。大鼠随机分组，每组5只，实验前禁食12 h，自由饮水。腹腔麻醉，腹主动脉取血后，分别取空肠、回肠各10 cm，结肠7 cm，放入K氏液中冲洗，至无内容物流出，小心剥离肠段表面的肠系膜和脂肪，将肠管一端结扎于自制塑料套管，翻转后结扎另一端，使之形成囊状。向肠囊中注入2 ml空白K氏液，将其移入已有K氏液的玻璃槽中平衡10 min后换成供试液100 ml，实验过程中保持37℃恒温，并向玻璃槽中通入0.95 O2/0.05 CO2，在给药后30、50、70、90 min 从肠囊内取样200 μl，同时补足相同体积的空白K氏液。将样品经13 000 r·min－1离心5 min，微孔滤膜过滤后，取续滤液5 μl进样测定样品中芒果苷含量。

2.4 数据处理

Q为药物各时间的累积吸收量，Cn为n时间点的实际检测浓度，Ci为样品浓度。

2.4.2 转运速率及表观渗透系数 Q对t做相关回归分析，得出斜率除吸收表面积，求得转运速率Vt。表观渗透系数按Paap=△Q/△t·A·C0计算，式中△Q为药物在△t时间内透过的量(μg);A为药物透过的表面积(本模型中为肠腔中膜面积);C0为肠囊外侧的初始给药浓度。

3 结果

3.1 UPLC测定方法 K氏液、知母、知母-黄柏中其他成分对芒果苷的测定无干扰，专属性较好(色谱图见Fig 1);芒果苷在0.2～96 mg·L－1浓度范围内线性关系良好，标准曲线方程为:Y=1.2×104X－2.2×103，r=0.9999;低、中、高(0.9，38.4，76.8 mg·L－1)3个质量浓度的芒果苷K氏液样品日内精密度RSD分别为0.54%，0.47%，0.29%;日间精密度RSD分别为1.36%，2.92%，1.92%。

3.2 芒果苷在不同肠段的吸收情况 芒果苷在空肠、回肠、结肠均有不同程度的吸收，并且在同一肠段Q随时间延长呈线性增加(Fig 2)。回肠的吸收参数Q90(90 min累积吸收量)、Vt和Paap均高于空肠组(P＜0.05)，芒果苷在不同肠段吸收趋势为回肠＞结肠＞空肠，结果见Tab 1。

3.3 P-gp抑制剂对芒果苷吸收的影响 在90 min内，Ver对芒果苷吸收有促进作用但不明显，而CsA组芒果苷在回肠的吸收量明显高于单体组(Fig 3)，Q90、Vt和Paap比单体组增大(P＜0.05)，提示芒果苷可能是P-gp底物，CsA明显提高芒果苷在回肠的吸收，见 Tab 1。

Tab 1Absorption parameters of mangiferin in different groups at intestinal segments(±s，n=5)

Tab 1Absorption parameters of mangiferin in different groups at intestinal segments(±s，n=5)

*P＜0.05 vs jejunum;#P＜0.05 vs mangiferin group at ileum

Intestine Group Q90/μg Vt/μg·cm－2·min－1 Paap/×10 －4，cm·min －1 Jejunum mangiferin 2.9484 ±0.7518 0.0041 ±0.0015 2.0350 ±0.7706 Colon mangiferin 4.3720 ±2.8159 0.0068 ±0.0048 3.3825 ±2.3781 Ileum mangiferin 6.4824 ±3.3958* 0.0104 ±0.0058* 5.1788 ±2.8999*mangiferin+Ver 11.4448 ±5.8714 0.0171 ±0.0113 8.5363 ±5.6694 mangiferin+CsA 13.1990 ±4.0660# 0.0206 ±0.0080# 10.3113 ±4.0032#Zhimu 12.7180 ±5.8105# 0.0204 ±0.0097# 10.190 ±4.8758#Zhimu-Huangbai 5.1304 ±2.0214 0.0079 ±0.00343.9650 ±1.7129

3.4 知母、知母-黄柏中芒果苷的吸收 Fig 3显示，90 min内知母组芒果苷在回肠的吸收量明显高于芒果苷单体组和知母－黄柏组(P＜0.05)，Q90、Vt和Paap(Tab 1)比单体组和知母－黄柏组均升高(P＜0.05)，而知母－黄柏组与单体组比较芒果苷吸收无差异。

Fig 1 UPLC chromatograms of mangiferin. A:Blank Krebs;B:Blank Krebs mixed with mangiferin;C:Sample from gut sacs.

4 讨论

离体组织实验必须考虑肠囊可能因离体时间太长而失去活性。文献资料［6－7］报道目前实验大部分在60～90min内，时间过长不能保证肠囊的生理活性，会导致肠囊的通透性发生变化。本实验曾以测定肠囊内营养液的乳酸脱氢酶的活力来评价肠细胞活性，结果显示大鼠离体肠段在90 min内可以保持肠细胞正常活性。

Fig 2 Accumulative absorption-time curves of mangiferin in different intestinal segments(±s，n=5)

本实验中芒果苷在空肠、回肠、结肠均有吸收，各个肠段Paap均大于1×10－4cm·min－1。回肠是芒果苷肠吸收的最佳部位，因此本实验选择回肠进一步研究P-gp抑制剂与知母、知母－黄柏对芒果苷吸收的影响。

Fig 3 Accumulative absorption-time curves of mangiferin in different test solutions at ileum(±s，n=5)

P-gp是由MDR1基因编码的膜蛋白，具有将药物从肠浆膜转运到肠黏膜而排入肠腔的作用，从而导致药物的吸收量减少［8］。在合用不同P-gp抑制剂后发现，CsA可以提高芒果苷在回肠K氏液中的浓度(P＜0.05)，而Ver作用不明显，但也有一定的促进作用。此结果提示芒果苷可能是P-gp的底物。

知母组中芒果苷的Q90、Vt和Paap高于芒果苷单体组和知母－黄柏组给药(P＜0.05)，这提示在知母水煎液给药组中，知母中其它成分明显促进了芒果苷的肠吸收;当伍用黄柏后芒果苷的吸收减少。前期曾对知母黄柏配伍对芒果苷大鼠体内药动学的影响［9］进行研究，发现知母中芒果苷的血药浓度和AUC(122.4 mg·L－1·h)比单体组(AUC 为0.626 mg·L－1·h)升高，配伍(1 ∶1)黄柏后 AUC(94.36 mg·L－1·h)下降，但仍明显高于单体组，同时达峰时间Tmax明显延长，表明配伍黄柏在一定程度上延缓了知母中芒果苷的吸收程度和速度，这与知母伍用黄柏后清热而不化燥、养阴而不助湿的功效相一致。本文知母中芒果苷吸收明显高于单体，与前期研究结果一致。配伍黄柏由于吸收延迟，而翻转肠囊实验时间仅为90 min，因此可能导致知母－黄柏组与单体组的肠吸收差异未完全显现。本研究也提示我们中药活性成分处于不同的处方环境则具有不同的吸收过程，研究其体内吸收应考虑复方多成分间相互作用。

［1］Prabhu S，Jainu M，Salfitha K E，et al.Role of mangiferin on biochemical alterations and antioxidant status in isoproterenol-induced myocardial infarction in rats［J］.J Ethnopharmacol，2006，107(1):126－33.

［2］Muruganandan S，Gupta S，Kataria M，et al.Mangiferin protects the streptozotocin-induced oxidative damage to cardiac and renal tissues in rats［J］.Toxicology，2002，176(3):165－73.

［3］Rivera D G，Balmaseda I H，Leon A A，et al.Anti-allergic properties of Mangifera indica L.extract(Vimang)and contribution of its glucosylxanthone mangiferin［J］.J Pharm Pharmacol，2006，58(3):385－92.

［4］徐福平，林爱华，刘奕明，等.UPLC同时测定黄柏知母药对中盐酸小檗碱、新芒果苷、芒果苷的含量［J］.中国药学杂志，2010，45(24):1951－3.

［4］Xu F P，Lin A H，Liu Y M，et al.Simultaneous determination of berberine，neomangiferin and mangiferin in Huangbai-Zhimu Decoction by UPLC［J］.Chin Pharm J，2010，45(24):1951－3.

［5］董 宇，张英丰，杨 庆，等.戊己丸提取物不同配伍的肠外翻吸收研究［J］.中国药理学通报，2010，26(10):1377－82.

［5］Dong Y，Zhang Y F，Yang Q，et al.Absorption of the different compatibility of extractive Wujiwan by everted gut sacs model［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(10):1377－82.

［6］郭竹君，崔志清，段宏泉.缚管翻转肠囊法研究委陵菜黄酮在大鼠小肠内的吸收行为［J］.天津医科大学学报，2009，15(3):348－50.

［6］Guo Z J，Cui Z Q，Duan H Q.Study on absorption of potentilla flavone in isolated rat small intestine utilizing everted-gut technique［J］.J Tianjin Med Univ，2009，15(3):348－50.

［7］何 卉，陈西敬，王广基.药物转运体在反式白藜芦醇肠道吸收中的作用［J］.中国药科大学学报，2008，39(4):324－8.

［7］He H，Chen X J，Wang G J.Effects of drug transporters on the intestinalabsorption oftrans-resveratrol［J］.J China Pharm Univ，2008，39(4):324－8.

［8］李 高，丁文峰，裘 军，等.利福平对地高辛小肠吸收作用的影响［J］.同济医科大学学报，2001，30(4):321－3.

［8］Li G，Ding W F，Qiu J，et al.The effect of Rifampin on the Intestine digoxin absorption［J］.Acta Univ Med Tangji，2001，30(4):321－3.

［9］林爱华，徐福平，刘奕明，等.知母黄柏配伍对芒果苷大鼠体内药物动力学的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(13):164－7.

［9］Lin A H，Xu F P，Liu Y M，et al.Effects of compatibility of Anemarrhenae Rhizoma and Phellodendri Chinensis Cortex on pharmacokinetics of mangiferin in rats［J］.Chin J Exp Tradit Med Formul，2011，17(13):164－7.