二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞分化的差异蛋白质分析

刘 瑶，向姝霖，袁静萍，3，何 洁，谢锦云，陈 平，梁宋平，苏 琦

(1.南华大学肿瘤研究所，湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室，湖南衡阳 421001;2.湖北省疾病预防控制中心食品药品安全性评价研究所，湖北武汉 430079;3.武汉市中心医院病理科，湖北武汉 430014;4.湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙 410081)

胃癌是最常见恶性肿瘤之一，发生率与死亡率分别占全球恶性肿瘤的8%与10%，而我国胃癌死亡率为25.2/10万，占恶性肿瘤的23.2%，是欧美发达国家的4.2～8.0倍［1-2］。二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜的一种脂溶性有效成分，对肺癌、乳腺癌、结肠癌和白血病等肿瘤均有明显的抑制作用，是一种有开发潜力的抗肿瘤药物［3-6］。我们先前的研究证实，DADS可体内外明显抑制人胃癌细胞增殖与诱导向正常细胞分化，但其分子机制尚未完全阐明［7］。本文研究DADS诱导人胃癌MGC803细胞分化过程中蛋白质的差异表达，进一步寻找胃癌分化的相关蛋白质及肿瘤相关标记物，为胃癌的诊断和治疗提供靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 MGC803细胞(山东师范大学生物系建株，为人胃低分化粘液腺癌，本实验室保存)用含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2温箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。

1.1.2 试剂 DADS为Fluka公司产品(d420=1.0，

Mr 146.28);小牛血清为杭州四季青公司产品;RPMI1640培养基为Gibco公司产品;二硫苏糖醇、尿素、CHAPS、固相pH梯度干胶条(IPG strip pH 3～10，18 cm)、IPG 缓冲液(pH 3 ～10)、覆盖液、蛋白银染试剂盒、低分子量标准蛋白质购自Amersham Biosciences公司;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、SDS、甘氨酸、硫代硫酸钠、碳酸氢氨、胰蛋白酶、PMSF、甘油等购自上海生工;乙腈为国产色谱纯;TPCK处理的胰蛋白酶、基质α-羟基肉桂酸、碘乙酰胺、三氟乙酸、铁氰化钾等购自Sigma公司。

1.1.3 仪器 IPGphor等电聚焦仪为Pharmacia公司产品;Voyager-DETM STR-MALDI-TOF-MS质谱仪为Applied Biosystem公司产品;垂直电泳仪、PDQuest软件为Bio-Rad公司产品;Speedvac公司的冷冻干燥离心机;Sigma公司的超速低温离心机;清华紫光的凝胶扫描仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞总蛋白的制备 30 mg·L-1的DADS处理24 h后，4℃预冷的PBS洗涤3次，吸净PBS，加入细胞裂解液(8 mol·L-1urea+4%CHAPS+40 mmol·L-1Tris+1%DTT+1 mmol·L-1PMSF+0.5%IPG buffer pH 3～10)冰盒上4℃静置30 min，用细胞刮匙刮取并收集裂解液，15 000 r·min-14℃离心15 min，取少量上清液用Bradford法测定总蛋白质的浓度，其余上清液置-80℃冰箱内保存备用。

1.2.2 第一向固相pH梯度等电聚焦 将含细胞总蛋白200 μg提取液与水化液(8 mol·L-1urea+4%CHAPS+18 mmol·L-1DTT+0.5%IPG buffer pH 3～10+痕量溴酚蓝)充分混合，以总体积350 μl加入IPG胶槽。将IPG干胶条去保护膜后胶面朝下，置入胶槽中，驱除气泡，并覆盖一层石蜡油，置于IPGphor等电聚焦仪的电极板上，水化和聚焦在20℃自动进行，总电压为37 920 Vh，其中在30 V水化 14 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 4 h 30 min。等电聚焦结束后立即取出IPG胶条分别于20 ml平衡液 A(50 mmol·L-1Tris-HCl pH 6.8+6 mol·L-1urea+30%甘油+1%SDS+0.2%DTT)和20 ml平衡液B(50 mmol·L-1Tris-HCl pH 6.8+6 mol·L-1urea+30%甘油+1%SDS+3%碘乙酰胺+痕量溴酚蓝)中各平衡15 min。

1.2.3 第二向垂直SDS-PAGE电泳 在灌好的SDS-PAGE胶面上加入1%的琼脂糖，然后将平衡后的胶条面朝外转移至胶的顶部，并且避免气泡产生，在胶的一端放入吸有低分子量Marker的滤纸片，安装好电泳槽后先用250 V 25mA电泳，待溴酚蓝迁移至浓缩胶(4.8%)和分离胶(12.5%)的界面时，换用500 V 50mA电泳至溴酚蓝前端到达底部约1 cm处停止电泳。整个过程用12℃循环水冷却。

1.2.4 蛋白质银染 按照蛋白质银染试剂盒的操作手册进行适当修改，依次经过固定(40%乙醇+10%冰乙酸)30 min;敏化(30%乙醇+0.2%硫代硫酸钠+6.8%乙酸钠);洗涤3次，每次5 min;银染(0.25%硝酸银)20 min;洗涤2次，每次1 min;显影(2.5%碳酸钠+0.0074%甲醛)2～5 min至斑点清晰为止;最后加入1.46%EDTA-Na2·H2O终止10 min。凝胶经扫描后用保鲜膜4℃保存。

1.2.5 凝胶图像分析 将经过银染的凝胶通过扫描成像，用PDQuest软件对图像进行背景消减、斑点检测、斑点匹配、量化等分析。

1.2.6 质谱样品的制备 在凝胶上选取重复性好、边界清楚的差异蛋白质点，切割后放入1.5 ml的Eppendorf管中用100 mmol·L-1硫代硫酸钠和30 mmol·L-1铁氰化钾(1 ∶1)脱色，100 mmol·L-1的碳酸氢铵+10 mmol·L-1的DTT于57℃还原1 h，再用100 mmol·L-1的碳酸氢铵 +55 mmol·L-1碘乙酰胺烷基化30 min，用 TPCK-处理的胰蛋白酶(100 g/700 L)37℃ 酶解 28 h，加入 100 μl 0.1%TFA震荡混匀，12 000 r·min-1离心5 min，取上清用Millipore公司的ZipTipTMC18微柱进行脱盐，与饱和的CCA基质液混合，点样于不锈钢点样板上，空气中自然干燥后准备上质谱分析。

1.2.7 质谱分析 样品置Voyager-DETMSTR-MALDI-TOF-MS质谱仪上分析，采用线性模式，正离子谱测定，离子源加速电压1为20 kV，加速电压2为18.85 kV，N2激光波长为337 nm，脉冲宽度为3 ns，离子延迟提取100 ns，真空度4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50次，并用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内标校正质谱峰，获得肽质量指纹图。

1.2.8 生物信息学分析 将获得的肽质量指纹图数据通过 MS-FIT软件上 http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/masfit.htm、http://www.expasy.ch及http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站进行查询。

1.2.9 统计学分析 实验数据均采用Student T-test法进行分析，数值用±s表示。

2 结果

2.1 DADS处理MGC803细胞总蛋白质的双向电泳银染图谱 Fig 1是DADS处理MGC803细胞前后的总蛋白质的双向电泳银染图谱。经扫描成像及PDQuest软件分析，对照组与处理组蛋白质点数分别为(576±14)个与(583±4)个。蛋白质点与参考胶的匹配结果，对照组与处理组平均匹配点分别为(434±24)个与(413±8)个(n=3)，其平均匹配率分别为76%和70%。

Fig 1 Images of 2DE of MGC803 cells proteome treated with DADS stained by silver

2.2 DADS处理MGC803细胞总蛋白质的双向电泳银染图谱的差异点分析 经PDQuest软件进行匹配分析，在两组图谱中有421个蛋白质斑点匹配，有200个点未匹配，其中与对照组相比相差2倍以上的有291个，相差10倍以上的有61个(Fig 2)。

Tab 1 Upregulated proteins of differentiation in MGC803 cells induced by DADS

Tab 2 Downregulated proteins of differentiation in MGC803 cells induced by DADS

Fig 2 Matching spots in treated and untreated MGC803 cells by DADS

2.3 差异蛋白质点的原位酶解和质谱分析 从PDQuest软件分析的差异点中选取部分重复性好、界限清楚的蛋白质点进行原位酶解后上质谱测定其肽质量指纹图谱，并经MS-FIT软件搜索相关数据库，初步鉴定结果有24个蛋白质点(Fig 3、4，Tab 1、2)。

Fig 3 Distribution of 24 disparate points analyzed by PDQuest software

3 讨论

我们已证实，DADS可抑制人胃癌MGC803细胞增殖，诱导ALP比活性与Con A凝集率下降，细胞骨架蛋白合成增加与重组，细胞GJIC恢复，细胞异型性下降，表面微绒毛减少，核变小，核浆比降低，常染色质增加，异染色质减少，具有向正常细胞分化倾向。机制与 G2/M阻滞，调节 ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1、激活p38、抑制 ERK/AP-1通路，上调组蛋白乙酰化、p21 WAF1等有关［7-10］。

Fig 4 Peptide mass fingerprinting of differential expression proteins

采用蛋白质组学技术是寻找疾病相关蛋白质、发现疾病标志分子的有效途径。本研究在DADS诱导人胃癌MGC803细胞分化过程中，发现24个与细胞分化、肿瘤转移、细胞凋亡、细胞周期、细胞免疫及代谢等相关的蛋白质，其中，gastric mucin、nM23、RORα、MHC DR-beta-1 chain、TCR 等上调，CDC2、uPAR、LIMK等下调。

CDC2(CDK1)是一种细胞周期依赖性蛋白激酶，CDK1与Cyclin B1复合物的活化是G2期进入M期的必要条件。我们已经证实，DADS阻滞MGC803细胞在G2/M期与影响CDK1/cyclin B1复合物形成有关［8，10］。本实验发现 DADS 处理的MGC803细胞CDC2表达下调，进一步验证上述结论。

胃粘膜蛋白MUC5AC是胃粘膜上皮分化的重要标志。研究证明，MUC5AC在正常胃粘膜高表达，而胃癌表达降低，且与侵袭与转移相关，提示MUC5AC可作为胃癌进展的重要预后参数［11］。本研究显示，DADS可上调MGC803细胞胃粘液蛋白，表明DADS可诱导胃低分化粘液癌细胞向正常胃粘膜分化。

nM23是一种抑制肿瘤转移因子。大量研究表明nM23表达与肿瘤的转移、分级、预后等密切相关。本实验结果表明经DADS处理的nM23蛋白表达上调，胃癌细胞的转移性下降。

RORα是核受体超家族中的一员，广泛分布于机体各组织，具有多种重要的生理功能。近年来，RORα在肿瘤中的作用成为研究的热点之一。本研究显示，DADS可上调RORα。研究表明，nm23等基因的启动子存在RORα反应元件，RORα磷酸化可通过削弱Wnt/β-catenin信号途径，发挥抑制肿瘤作用。因此，RORα具有重要的抗肿瘤作用，是肿瘤治疗的一个可能的潜在靶点［12］。

uPAR是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的蛋白质，与uPA结合可调控ECM蛋白水解，活化Src、FAK、Rac、ERK/MAPK和JAK/STAT等信号途径，在细胞增殖、侵袭和转移起着重要作用。近年来，发现uPAR在肿瘤趋向性、上皮-间质转变与胞葬作用等具有新功能，并可能成为治疗肿瘤的靶点［13］。本研究显示DADS可下调uPAR，推测DADS可能通过减少uPAR表达而抑制胃癌的迁移与侵袭。

LIMK家族主要有LIMK1和LIMK2，在肿瘤迁移侵袭过程中起着非常重要的作用。LIMK1可通过Rho-ROCK1/PAK1-LIMK1-Cofilin通路，影响肌动蛋白细胞骨架结构以及细胞形态、黏附与侵袭转移。LIMK1在许多肿瘤组织中高表达并参与肿瘤生长、血管形成及迁移侵袭过程［14］。本研究显示，DADS能下调MGC803细胞LIMK，可能与抑制胃癌侵袭转移有关。我们已证明，DADS可抑制人结肠癌细胞迁移、侵袭与下调 LIMK1有关［15］。

在免疫应答过程中，由MHC-抗原肽-TCR三分子复合物传递抗原信息，启动T细胞激活和免疫应答，MHC是TCR的配体。Toll/Interleukin-1 receptor-like3(TLR3)可通过激活NF-kappaB参与免疫调节。本研究显示，DADS可上调MGC803细胞HLADR-beta-1与TCR，下调 TLR 3，表明 DADS可能通过增强免疫效应，发挥抗肿瘤的作用。

此外，本研究在DADS诱导MGC803细胞分化中还发现下调CA antigen NY-CO-45、Dnmlp/Vpsiplike protein、h-neuro-d4 protein、phosphodiesterase、KIAA0692 protein、transcobalamin Ⅱ、HnRNP F protein、NF-AT3及一种未知蛋白，上调X-linked inhibitor of apotosis、proteinkinase、Malate dehydrogenase precursor、Kruppel-related zinc finger protein、Snake venomlike protease与endothelial cell protein C/APC receptor等16个蛋白，作用机制尚需进一步研究。

综上所述，DADS诱导MGC803细胞分化中有许多不同功能的蛋白质从多种途径参与了这一过程。尚需进一步对其它差异蛋白质点进行鉴定与确证，以筛选并获得与胃癌分化相关的分子标志物，为进一步发现相关标记物以及胃癌的诊断和治疗提供靶点。

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