RP-HPLC法测定重酒石酸氢可酮原料药中有关物质的含量

李诗草，李宏名，杨 红，马玉洁，蒲 刚（中国医药集团四川抗菌素工业研究所，成都 610051）

氢可酮为半合成的麻醉、镇痛和镇咳药物，临床应用的上市品均为氢可酮的复方制剂，如氨酚氢可酮片、复方重酒石酸氢可酮/布洛芬片等。目前，重酒石酸氢可酮尚未载入《中国药典》2010年版，《美国药典》（USP）及《欧洲药典》（EP）均有本品收载，但现行版USP 32[1]本品项下无有关物质检查，而现行版EP 6.0[2]本品标准中列入了有关物质检查项，方法为梯度洗脱反相高效液相色谱（RP-HPLC）法。本研究依据EP 6.0的有关物质检查方法，再结合实际生产工艺路线和产品有关物质检查结果，建立了有效可控的检查重酒石酸氢可酮中有关物质的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200型HPLC仪（美国Agilent公司）；HPLC系统，包括LC-20 AB泵、SPD-20 A检测器、SIL-20 AC自动进样器、LC solution色谱工作站（日本Shimadzu公司）；XS205型十万分之一分析天平（瑞士Mettler公司）；PHS-3 C型酸度计（天津大学精密仪器厂）。

1.2 试药

重酒石酸氢可酮原料药（四川抗菌素工业研究所与国药集团工业有限公司廊坊分公司共同制备，批号：070601、070602、070603，纯度：98.8%、99.6%、98.9%）；杂质A吗啡对照品（批号：171201-200822，纯度：99.8%）、杂质B酒石酸双氢可待因对照品（批号：171252-200401，纯度：100.0%）、杂质I蒂巴因对照品（批号：171216-200403，纯度：100.0%）均来自中国食品药品检定研究院；杂质C磷酸可待因对照品（国药集团工业有限公司廊坊分公司，批号：LK100303，纯度：99.4%）；杂质D盐酸羟考酮对照品（北京华素制药股份有限公司，批号：0908261，纯度：99.3%）；杂质E可待因酮对照品（德国LGC Gmbh公司，批号：04.02.09.19，纯度：99.0%，供实验室使用）；杂质F甲基可待因对照品（欧洲药品质量管理局，批号：3.1，纯度：99.0%，供实验室使用）；杂质H二苯甲酮对照品（天津市博迪化工有限公司，化学纯）；重酒石酸氢可酮对照品（四川抗菌素工业研究所，批号：021201，纯度：99.5%）；酒石酸（L（+），天津开发区海光化学制药厂，批号：031102，纯度：＞99.5%）；乙腈为色谱纯，水为自制纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-2（150 mm× 4.6 mm，5µm）；流动相：A为辛烷磺酸钠1.08 g，加水约950 mL，用磷酸调节pH值2.0，加水稀释至1000mL，B为乙腈，梯度洗脱，流速：1.5mL·min－1；检测波长：283 nm；柱温：40℃；进样量：10µL。梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC梯度洗脱程序Tab 1 HPLC gradient elution procedure

2.2 溶液制备

取本品适量，加流动相A溶解并稀释制成10.0 mg·mL－1的溶液，作为供试品溶液。分别取重酒石酸氢可酮对照品和盐酸羟考酮对照品（杂质D）约5 mg，置于5 mL量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液（a）。精密量取1 mL供试品溶液，置于100 mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为对照溶液（b）。取二苯甲酮对照品（杂质H）约20 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL，置于20 mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（c）。取各有关物质对照品A、B、C、D、E、F、H、I与重酒石酸氢可酮对照品制成浓度分别约为0.2 mg·mL－1的混合溶液，作为对照溶液（d）。取酒石酸适量，用流动相A溶解并稀释制成每1 mL中含3.0 mg的溶液，作为空白溶液。

2.3 有关物质测定

取系统适用性试验溶液（a）10µL进样，记录色谱图，羟考酮与氢可酮色谱峰之间的分离度应大于3.0。取对照溶液（d）10µL进样，记录色谱图，各有关物质与氢可酮的相对保留时间为：吗啡（杂质A，0.32）、双氢可待因（杂质B，0.57）、可待因（杂质C，0.61）、羟考酮（杂质D，0.84）、可待因酮（杂质E，1.1）、甲基可待因（杂质F，1.5）、二苯甲酮（杂质H，3.1）、蒂巴因（杂质I，2.1）。

取对照溶液（b）10µL进样，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%，精密量取供试品溶液与对照溶液（b）、（c）和空白溶液各10µL，分别进样，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中，除与空白溶液相同位置的色谱峰外，如有与杂质相对保留时间一致的色谱峰，杂质A、B、C、D、E、F、H、I的峰面积不得大于对照溶液（b）中氢可酮峰面积的2倍（0.2%），杂质I峰面积乘以0.2的校正因子后其值不得大于对照溶液（b）中氢可酮的峰面积（0.1%），杂质H的峰面积不得大于对照溶液（c）中二苯甲酮峰面积的0.5倍（0.1%），单个未知杂质的峰面积不得大于对照溶液（b）中氢可酮的峰面积（0.1%），各杂质峰面积和不得大于对照溶液（b）中氢可酮峰面积的10倍（1%），供试品溶液中任何小于对照溶液（b）中氢可酮峰面积0.5倍以下的杂质小峰可忽略不计（0.05%）。

2.4 专属性试验

2.4.1 本品与有关物质的分离。照“2.2”、“2.3”项下方法试验，氢可酮与8个有关物质混合分离的情况见图1。

图1 分离试验高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of separation tests

图1 结果表明，氢可酮与羟考酮分离度为3.25，符合EP要求分离度不得小于3的规定，8个有关物质与氢可酮完全分离，各杂质峰的相对保留时间与EP方法基本一致。

2.4.2 破坏性试验。（1）酸破坏。取本品（批号：070601）20 mg置于10 mL量瓶中，加1 mol·L－1盐酸溶液2 mL，于热水浴中加热5 h，冷却后，用1 mol·L－1氢氧化钠中和，用流动相A稀释至刻度，摇匀。（2）碱破坏。取本品（批号：070601）20 mg置于10 mL量瓶中，加1 mol·L－1氢氧化钠溶液2 mL，于热水浴中加热5 h，冷却后，用1 mol·L－1盐酸中和，用流动相A稀释至刻度，摇匀。（3）氧化破坏。取本品（批号：070601）20 mg置于10 mL量瓶中，加3%过氧化氢溶液12mL，室温26℃放置5h。（4）光照破坏。取经4500 lx强光连续10 d照射后的样品（批号：070601）适量，用流动相A溶解并稀释制成每1mL中含2.0mg的溶液。（5）高温破坏。取本品（批号：070601）经120℃烘烤3 h处理后，呈熔融状，取适量，用流动相A制成约10 mg·mL－1溶液。

分别精密量取上述溶液10 μL进样，记录色谱图，结果重酒石酸氢可酮经各种条件破坏，产生的杂质峰与主成分峰均能有效分离，表明方法的专属性强，详见图2。

图2 专属性试验高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms for the specificity tests

2.5 线性关系试验

取重酒石酸氢可酮适量，精密称定，用流动相A溶解并稀释成1.02、5.10、10.20、15.31、20.41µg·mL－1的系列溶液，进样分析。以氢可酮峰面积（y）对浓度（x）进行线性回归，得回归方程y＝1.2208 x+0.0523（r＝0.9997），结果表明，氢可酮检测浓度线性范围为1.02～20.41µg·mL－1。

取杂质I（蒂巴因）适量，精密称定，用流动相A溶解并稀释成0.51、1.02、5.08、10.17、15.25、20.34µg·mL－1的系列溶液，进样分析，同样得回归方程y＝12.546 x－0.6004（r＝0.9999），结果表明，蒂巴因检测浓度线性范围为0.51～20.34µg·mL－1。

取杂质H（二苯甲酮）适量，精密称定，制备成0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00µg·mL－1的系列溶液，进样分析，同样得回归方程y＝10.151 x+3.577（r＝1.0000），结果表明，二苯甲酮检测浓度线性范围为0.10～40.00µg·mL－1。

2.6 检测限和定量限试验

分别将氢可酮、蒂巴因、二苯甲酮的对照品溶液逐步稀释后进行测定，信噪比按3∶1计，得氢可酮、蒂巴因、二苯甲酮检测限分别为0.05、0.005、0.005µg；信噪比按10∶1计，三者定量限分别为0.15、0.015、0.015µg。

2.7 对照溶液进样精密度试验

分别精密量取“2.2”项下的对照溶液（b）和对照溶液（c）连续进样6次，进样测定，记录色谱图，结果，氢可酮和二苯甲酮对照溶液峰面积的RSD分别为0.097%和1.54%，表明进样精密度良好。

2.8 中间精密度试验

照“2.3”项下有关物质测定方法，对同一样品（批号：070601）在不同日期、不同仪器、不同操作人员进行中间精密度试验，结果，样品中总杂质平均含量为0.02%，RSD为4.0%。由于杂质含量很低，所以相对标准偏差较大，但检查方法的精密度完全能满足本品有关物质限度检查的要求。

2.9 杂质漏检与色谱峰纯度的考察

为测定主峰纯度因子，对样品及A、B、C、D、I、H杂质混合溶液在190～400 nm波长范围内进行二极管阵列紫外扫描检测。结果，主成分与有关物质在190～330 nm波长范围都有相似的紫外吸收谱，且末端吸收较大，在283 nm波长处都有特征吸收峰；在283 nm波长测定峰纯度数据显示，样品测定中氢可酮保留时间为13.045min（批号：070601）的主峰纯度因子为999.668（大于980），表明主峰为单峰，可推测方法基本无杂质漏检。

2.10 耐用性试验

选用6种不同品牌不同长度的C18色谱柱，照有关物质检查方法进行测定。结果表明，使用不同品牌及规格的色谱柱进行分析时，其分离效果、检出杂质峰个数及有关物质检查结果均吻合，说明所建方法耐用性较好。

2.11 样品的有关物质检查结果

2.11.1 HPLC法。将生产规模长期留样考察4年的3批稳定性样品，按“2.3”项下方法进行有关物质检查，结果3批样品中单个杂质均为0.01%，总杂质最高的为0.03%。样品中未检出已知杂质峰，未知杂质含量很低，样品符合EP杂质限度规定，也说明样品稳定性较好。

2.11.2 薄层色谱（TLC）法。将生产规模室温留样的3批稳定性考察样品，照《中国药典》TLC法（附录ⅤB）[3]（本品临床标准的有关物质检查法）进行检查，结果，3批样品均无杂质斑点。

3 讨论

3.1 关于线性考察化合物的确定

由于在EP中，杂质H是用杂质对照品的外标法规定其限度，杂质I是用加校正因子的主成分自身对照法规定其限度，其他杂质均用不加校正因子的主成分自身对照法限制含量，故本试验只选取了重酒石酸氢可酮、杂质H和杂质I进行线性考察。

3.2 有关物质检查方法选择及杂质限度确定依据

由于HPLC方法有明显的优点，所以建议在重酒石酸氢可酮生产申报质量标准中，将TLC有关物质检查方法改为RPHPLC梯度洗脱方法，并根据样品有关物质检查的实际结果，即在已知杂质的相应保留时间处未检出有杂质峰，而检出的未知杂质含量很低，单个杂质及总杂质完全符合EP杂质限度规定，因此在标准中制订了控制这些已知杂质的限度（与EP限度一致），使该标准能有效控制产品质量。

3.3 色谱柱的选择

通过耐用性试验，结果显示规格为250 mm×4.6 mm、粒度为5µm的色谱柱分离的主峰保留时间较长，2个主峰的分离度较高；而规格为150 mm×4.6 mm、粒度为5µm的色谱柱分离的主峰保留时间较短，当调整流速为1.2 mL·min－1时，短柱分离保留时间较适宜，与EP主峰保留时间和各杂质的相对保留时间基本一致。因此，在使用不同品牌及规格的色谱柱进行分析时，仅对流速稍加调整就能达基本一致的分离效果。

3.4 检测波长选择

选择在283、240、230、220nm不同波长处对样品（批号：070601）和空白溶液进行HPLC分析，结果显示虽然在低波长处杂质检查灵敏度较高，但溶剂峰干扰较大，加之样品杂质含量极少，所以选低波长对杂质含量的准确测定影响较大。又因在氢可酮特征吸收的高波长283 nm处检出的有关物质峰个数与其他低波长处相同，且已知杂质也在283 nm波长处有相同的特征吸收，而该波长测定能排除溶剂峰干扰，因此选择283 nm波长作为检测波长。

3.5 酒石酸空白溶剂峰的扣除

试验发现酒石酸空白溶液与样品中1.38 min处出现的小峰基本一致，所以杂质含量计算需扣除酒石酸空白溶液峰。以有关物质检查方法供试品溶液浓度为10.0 mg·mL－1时，按分子式中酒石酸与氢可酮比例为1∶1，推算相当的酒石酸空白溶剂制备浓度是3.0 mg·mL－1（以流动相A制备）。

本法与EP法相比，色谱条件基本相同，流速稍有差别，色谱柱长度不同。对于检查方法中的各杂质保留时间定位，EP方法中没有杂质溶液的制备方法，笔者规定制备成各杂质混合溶液，一次进样定位，使方法省时、简便。另对照溶液的制备方法也不同，在不影响杂质检查结果准确的前提下，笔者将杂质对照品取样量减少一半制备溶液，从而降低了购买昂贵杂质对照品的成本。本文还比较了TLC法与HPLC 2种有关物质检查的结果，结果表明HPLC法比TLC法专属性强、灵敏度高、重复性好。因此，RP-HPLC梯度洗脱方法更适宜于重酒石酸氢可酮有关物质的检查。

[1]The United States Pharmacopoeial Convention.USP32-NF27[S].Rockville：the United States Pharmacopoeial Convention，2009：2568.

[2]European Directorate for the Quality of Medicines.European Pharmacopeia 6.0（Vol 2）[S].Strasbourg：European Directorate for the Quality of Medicines，2008：2087-2093.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录27.