丙戊酸体内分析方法研究进展Δ

毛桂福

（柳州市妇幼保健院药剂科，广西柳州 545001）

丙戊酸体内分析方法研究进展Δ

毛桂福＊

（柳州市妇幼保健院药剂科，广西柳州 545001）

目的：综述丙戊酸的体内分析方法，为丙戊酸的临床药学研究提供方法学参考。方法：通过查阅大量国内、外文献，总结了常用仪器分析方法在丙戊酸体内分析中的应用进展。结果：丙戊酸体内药物浓度的分析方法有多种，常用有高效液相色谱法、液质联用技术、气相色谱法、高效毛细管电泳法和荧光偏振免疫分析法等。结论：目前最常用的分析方法为荧光偏振免疫分析法和高效液相色谱法；随着液质联用仪的普及，分离效率高、分析速度快的液质联用技术有望成为血药浓度监测的主要方法。

丙戊酸；体内分析；高效液相色谱法；液质联用；气相色谱法；高效毛细管电泳法；荧光偏振免疫分析法；均相酶免疫分析法

丙戊酸（Valproic acid，VPA）是一种广谱抗癫痫药，对全身性癫痫的失神发作、肌阵挛发作和强直性阵挛发作有效，对单纯部分性发作和复杂性部分发作也有一定疗效。VPA的治疗浓度范围窄、个体差异大，治疗过程中须监测血药浓度，以达到个体化合理用药之目的。VPA分子无特征性的紫外吸收，其血药浓度的测定一直是体内药物分析的难点。本文系统归纳了现有的VPA分析方法，特别是对衍生化高效液相色谱（HPLC）法进行了详细阐述。

1 HPLC法

HPLC法是20世纪70年代发展起来的一种定量分析方法，具有准确、专属性强、重现性好等优点，在药物的体内分析领域有广泛应用。由于VPA分子结构缺乏生色基团，HPLC法监测VPA的血药浓度，大多需要将VPA柱前衍生化生成具有紫外吸收或荧光的酯类，再用紫外检测器、二极管阵列检测器或荧光检测器等检测。常用的紫外检测波长有248、254、262、300 nm等。不经过柱前衍生化处理而直接测定的高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）法[1]报道较少。

血样中VPA通常采用液-液萃取法提取。由于VPA的p Ka值为4.95，血样一般需用硫酸或盐酸等酸化处理。常用的萃取溶剂有正戊烷、正己烷、乙醚、氯仿、二氯甲烷和乙腈等，或它们的混合溶剂。衍生化后的溶液经固相萃取法处理，可除去反应液中残余的衍生化试剂，减少衍生化试剂对测定的干扰，有利于色谱柱的保护。

柱前衍生化-HPLC法测定血清中VPA，通常采用C18柱，以甲醇-水或乙腈-水等二元流动相进行分离，并常用环己烷羧酸、1-环己烷烯羧酸、正庚酸、辛酸、壬酸、十一碳烯酸等作内标。该方法主要的区别是样品预处理过程中衍生化方法的不同，各衍生化条件详见表1。常用的衍生化试剂有α-溴苯乙酮、2，4´-二溴苯乙酮（DBrMP）、2-溴-对硝基苯乙酮、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC）、4-溴甲基-6，7-二甲氧基香豆素（BrDMC）、N-（1-萘基）乙二胺和2-（2-萘氧基）乙基-2-（哌啶）乙磺酸酯等。衍生化试剂、催化剂、反应温度、反应时间以及氮气流速等直接影响VPA衍生物的生成，进而影响VPA的测定[2，3]。常见的柱前衍生化-HPLC法分述如下。

1.1 α-溴苯乙酮衍生化法

付翠香等[2]用α-溴苯乙酮作衍生化试剂建立了HPLC法测定VPA血药浓度。VPA浓度在15～200μg·mL－1范围内线性关系良好，平均回收率、RSD都能满足测定要求，最低检测浓度为0.2μg·mL－1。三乙胺作为催化剂能中和反应中生成的溴化氢，使VPA酯化完全。适当增加衍生化试剂用量有助于增加VPA衍生物的生成量，但过多不利于色谱柱的保护。苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平等抗癫痫药对测定无干扰。该方法国内外文献报道[3，4]较多，样品处理方法大多类似。

1.2 DBr MP衍生化法

Chen等[5]用DBrMP作衍生化试剂建立了HPLC法测定血浆中VPA和主要代谢物2-丙基-4-戊烯酸的浓度。两者分别在5～200μg·mL－1和0.5～20μg·mL－1范围内有良好的线性关系，最低定量限分别为5μg·mL－1和0.5μg·mL－1，日内和日间RSD在－3.0%～7.5%范围内。

1.3 2-溴-对硝基苯乙酮衍生化法

表1 HPLC测定血清中丙戊酸的衍生化条件

石苏英等[6]建立了测定VPA血药浓度的HPLC法。血清样品经正己烷提取后，加入2-溴-对硝基苯乙酮在50℃水浴中放置15 min即可完成衍生化反应。VPA的最低检测限为0.2μg·mL－1，提取回收率为83.0%～86.3%。周莉华等[7]也采用2-溴-对硝基苯乙酮作衍生化试剂建立了HPLC法测定VPA的血药浓度。

1.4 Br MMC衍生化法

陈湛芳等[8]采用BrMMC作衍生化试剂建立了HPLC-UV法测定VPA血清浓度。VPA的衍生化反应需用含10 mg·mL－1碳酸钾的冠醚混悬液催化，于65℃水浴避光反应30 min。衍生物在－20℃避光储放1周或室温避光储放72 h稳定，血样在－30℃冻存3个月基本稳定。Gill等[9]以环己烷羧酸为内标、BrMMC为衍生化试剂，建立了HPLC-荧光法测定VPA血浆浓度，激发波长和发射波长分别为330 nm和395 nm。最低定量浓度为2.47μg·mL－1，批内和批间RSD≤8.6%。并用该方法进行了3种VPA肠溶片的生物等效性研究。

1.5 Br DMC衍生化法

赵侠等[10]通过用BrDMC与VPA衍生化，建立了HPLC-荧光检测法测定VPA的血药浓度，衍生化需在60℃水浴中反应40 min，冷却后用荧光检测器检测，激发波长为325 nm，发射波长为398 nm。VPA的最低定量限为1 mg·L－1。该方法灵敏度高、专属性好，并用于VPA口服溶液生物等效性的研究。

1.6 N-（1-萘基）乙二胺衍生化法

Kamalinia等[11]通过VPA与N-（1-萘基）乙二胺衍生化，建立HPLC法测定了VPA的血药浓度。在100μL N，N′-二环己基碳酰亚胺（5 mg·mL－1）和N-羟基丁二酰亚胺（二者物质的量之比为1∶3.6）的催化下，衍生化反应于85℃水浴中保温60 min即可完成。衍生物在室温放置3 d仍稳定；VPA在0.1～100μg·mL－1浓度范围内线性关系良好，检测限为10 ng·mL－1。该方法比以往报道的HPLC-UV法和HPLC-荧光检测法都灵敏，但反应时间太长，且所用溶剂都需要经过硫酸钠干燥。

2 液-质联用（LC-MS）技术

LC-MS技术是最近几年才发展起来的一种新的分析方法，具有高效、灵敏、特异性强等优点，其缺点是需要昂贵的仪器设备和具有高技术水平的工作人员。杨学志等[12]建立LC-MS法测定人血清中VPA浓度：采用Zorbax SB C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5μm），以乙腈-水（60∶40）为流动相，流速0.3 mL·min－1，柱温30℃，血浆样品经乙腈沉淀蛋白后进样分析。采用电喷雾电离源（ESI）负离子源，用选择离子监测方式进行定量分析。VPA在0.5～100μg·mL－1浓度范围内线性关系良好，最低检测浓度为0.1μg·mL－1。该方法操作简单、结果准确、灵敏度高、耗时少，适用于VPA血药浓度监测及药动学研究。Gao等[13]和Matsuura等[14]也建立了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测定人血中VPA或代谢物的浓度。

3 气相色谱（GC）法

GC法是最早发展起来的一种仪器分析方法，具有分离效能高、灵敏度高、用样量少等优点。由于VPA具有一定的挥发性和热稳定性，早期监测其血药浓度应用GC法较多。张华年等[15]用程序升温毛细管GC法监测VPA血药浓度。选用ATSE-54石英毛细管色谱柱（21 m×0.53 mm，1.0μm）为色谱柱，用火焰离子化检测仪（FID）检测VPA血药浓度。VPA在20～300 mg·L－1范围内线性关系良好，最低检测浓度为1 mg·L－1，相对回收率在96%以上，日内和日间RSD＜7.6%。该方法不需要衍生化处理样品，操作简便、准确可靠，但一个测定周期仍需耗时1 h左右。Farajzadeh等[16]用固相微萃取毛细管GC法检测人血中VPA的浓度，该方法线性范围宽（0.25～100 mg·L－1），检测限低（85μg·L－1），RSD＜7%。

4 高效毛细管电泳（HPCE）法

HPCE法是近年来发展较快的一种新型高效快速的分离分析技术，具有分辨率和灵敏度高、快速、耗费低、样品预处理简单等特点。Belin等[17]以己酸为内标建立毛细管电泳法测定体液中VPA：血样经乙腈沉淀蛋白后，采用石英毛细管柱（50μm×50 cm）分离，以10 mmol·L－12-（N-吗啉代）乙磺酸/DL-组氨酸溶液（pH 6.0，含50μmol·L－1西曲溴铵）为电泳缓冲液，分离电压30 kV，电泳时间3 min，虹吸方式进样10 s，电容耦合非接触电导检测器检测。结果VPA在2～150μg·mL－1浓度范围内具有良好的线性关系，最低检测浓度为80 ng·mL－1。

5 荧光偏振免疫分析（FPIA）法

FPIA法具有自动化程度高、不需要样品处理、简便快速等优点，是目前国内外监测血药浓度选择的主要方法。其缺点是设备、试剂价格较高。2010年孔晶等[18]对监测VPA血药浓度的FPIA法进行了质量评价，结果表明平均回收率及相对标准差等符合《中国药典》对生物样品测定方法的规定。唐荣福等[19]用FPIA FLX法检测了2～8℃冰箱中储存不同时间的VPA血清样品，结果表明，血清中VPA放置1周内稳定，放置2周后不稳定。

6 均相酶免疫分析（EMIT）法

EMIT法是利用抗原（药物）及标记抗原（葡萄糖-6磷酸脱氢酶标记的药物）竞争与抗体相互识别、结合来产生检测信号的。EMIT法自动化程度高、无需对样品预处理，适用于急诊及批量测定，但该法仪器和试剂成本较高。黄文莺等[20]以EMIT法采用全自动免疫分析仪测定了VPA血药浓度，并与HPLC的测定结果进行比较。结果VPA在1～150 mg·L－1浓度范围内时，HPLC和EMIT两种方法的准确度无显著性差异，但HPLC法精密度更好；两种方法测定结果存在高度相关性，但是当测定标本的VPA浓度小于10 mg·L－1时宜用HPLC法测定。

7 小结

目前，测定VPA血药浓度最常用的方法是FPIA法和HPLC法。FPIA法具有简便快速等优点，但需用专用仪器及试剂盒，耗费较多，且VPA代谢产物对测定有干扰，该方法难于在基层医院推广使用。而HPLC法需要柱前衍生化，操作烦琐，不适于大批量样品测定；但HPLC仪在国内较普及，测定结果准确，因而该方法在基层单位仍广泛应用。衍生化试剂、催化剂、反应温度和时间以及氮气流速等影响VPA衍生化反应，因此需对这些因素进行考察，从而确定最佳反应条件，以保证测定结果的准确性、重复性。LC-MS法具有分离效率高、不需要衍生化处理等优点，随着LC-MS仪的普及，LC-MS法有望成为VPA血药浓度监测的主要方法。

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R914

A

1001-0408（2012）46-4393-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.46.28

2011-12-07

2012-06-11）