胡黄连中酚类化合物的分离及UPLC-ESI-MS分析*

刘时乔 ，张新鑫 ，单 淇 ，周福军 ，侯文彬 ，

（1.天津中医药大学，天津 300193，2.天津药物研究院，天津 300193）

胡黄连为中国传统中药的清虚热要药，最早记于《唐本草》，具有清热、凉血、燥湿、消疳功效，用于骨蒸劳热、黄疸、冷热泄痢、小儿疳积、自汗、盗汗、痔瘘和疮肿等证的治疗[1]。2010版《中国药典》收载的胡黄连品种为西藏胡黄连（Picrorhiza scrophulariiflora Pennell）的干燥根茎。近年来，国内外学者对西藏胡黄连的化学成分进行了的研究，从中主要分离得到3大类化合物，分别为环烯醚萜类、酚苷类和葫芦烷类皂苷类化合物[2-3]。目前关于胡黄连中环烯醚萜类化合物的分析报道已经较为充分，但是对于其酚类成分的分析报道很少，尚未见超高效液相色谱与电喷雾质谱（UPLC-ESI-MS）技术对胡黄连中酚类成分分析测定的报道。本实验对胡黄连化学成分进行了较为深入的研究，从胡黄连的乙醇提取物中获得6个酚类化合物，分别为云杉苷（Ⅰ）、草夹竹桃苷（Ⅱ）、藏黄连酚苷A（Ⅲ）、藏黄连酚苷F（Ⅳ）、香草酸（Ⅴ）和香草乙酮（Ⅵ）。首次采用 HPLCESI-MS技术对该6个酚类成分进行了含量测定。为胡黄连原药材和提取物的质量控制以及复方中的酚类化合物的研究，及合理开发利用胡黄连资源提供了理论依据。

1 仪器与材料

Waters ACQUITY UPLC液质联用色谱仪为美国Waters公司生产，离子源为电喷雾离子化正离子采集模式（ESI＋），毛细管电压：3.2 kV 和电喷雾离子化负离子采集模式（ESI－），毛细管电压：－2.8 kV。BruckAC－400P型超导核磁共振仪为瑞士Bruck公司生产，其中氢谱为400 MHz和600 MHz，碳谱为100 MHz和150 MHz。制备用高效液相色谱（HPLC）法，HPLC－ODS柱C18（250 mm×10 mm，5 μm）Agela公司生产，薄层硅胶及柱色谱硅胶均由青岛海洋化工厂生产，甲醇（色谱级）和乙腈（色谱级）为Fisher公司生产，其余试剂均为分析纯，由天津市康科德科技有限公司生产。

胡黄连药材购买自河北省安国市祁澳饮片厂，按《中国药典》2010版第一部226页鉴定本品为玄参科植物胡黄连的干燥根茎。

2 提取分离与结构鉴定

2.1 提取分离 胡黄连干燥根茎2 kg，用70%的乙醇加热回流提取3次,每次2 h，提取液减压浓缩回收溶剂至无醇味，经大孔树脂AB-8纯化，水—乙醇梯度洗脱，得水洗部分、20%乙醇洗脱部分、40%乙醇洗脱部分、60%乙醇洗脱部分、80%乙醇洗脱部分等。经预实验，60%乙醇洗脱部分含有大量的酚类成分。故选取60%乙醇洗脱浸膏200 g，经硅胶柱层析，三氯甲烷—甲醇梯度洗脱，所得流分再分别经硅胶柱层析、SephadexLH-20和制备高效液相色谱（HPLC)纯化，得到6个酚酸类化合物，分别为化合物Ⅰ（60 mg）、化合物Ⅱ（200 mg）、化合物Ⅲ（100 mg）、化合物Ⅳ（20 mg）、化合物Ⅴ（100 mg）和化合物Ⅵ（30 mg）。

2.2 结构鉴定 化合物Ⅰ：白色针状结晶（甲醇），ESI-MS m/z：321（M＋Na＋），297（M－H－），提示本品的分子量为 298。1H-NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.91（2H，d，J＝8.8 Hz，H－2，6），7.10（2H，d，J＝8.8 Hz，H－3，5），5.01（1H，d，J＝5.2 Hz，H－1′），3.11－4.54 为糖质子信号；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：131.5（C－1），130.9（C －2，6），116.5（C －3，5），161.1（C －4），197.1（C－7），27.1（C－8），100.4（C－1′），73.8（C－2′），77.8（C－3′），70.3（C－4′），77.2（C－5′），61.3（C－6′）。以上数据与文献报道基本一致[4]，鉴定该化合物为云杉苷。

化合物Ⅱ：白色针状结晶（甲醇），ESI-MS m/z：351（M＋Na＋），327（M－H－），提示本品的分子量为328。1H-NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.46（1H，brs，H－2），7.17（1H，d，J＝8.8 Hz，H－5），7.57（1H，dd，J＝2.0，8.8 Hz，H－6），2.53（3H，s，H－8），3.82（1H，s，OCH3），5.01（1H，d，J＝5.2 Hz，H－1′），3.12－4.53 为糖质子信号；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：130.8（C－1），111.0（C－2），150.6（C－3），148.7（C－4），114.1（C－5），122.6（C－6），197.1（C－7），27.1（C－8），100.4（C－1′），73.1（C－2′），76.8（C－3′），69.5（C－4′），77.1（C－5′），60.5（C－6′），55.6（OCH3）。以上数据与文献报道基本一致[4]，鉴定该化合物为草夹竹桃苷。

化合物Ⅲ：白色无定形粉末，ESI-MS m/z：663（M＋Na＋），639（M－H－），提示本品的分子量为 640。1HNMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.44（1H，d，J＝2.0 Hz，H－2），7.30（1H，dd，J＝2.0，8.4 Hz，H－5），7.14（1H，d，J＝8.4 Hz，H－6），2.47（1H，s，H－8），3.80（1H，s，OCH3），7.45（1H，d，J＝2.0 Hz，H－2′），7.18（1H，d，J＝8.4 Hz，H－5′），7.52（1H，dd，J＝2.0，8.4 Hz，H－6′），3.78（1H，s，OCH3），5.13 （1H，d，J＝7.2 Hz，H－1″），5.04（1H，d，J＝7.2 Hz，1″′），3.18－5.01 为糖上质子；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：150.25（C－1），148.60（C－2），111.01（C －3），130.84（C －4），122.19（C －5），114.09（C－6），196.45（C－7），26.38（C－8），122.92（C －1′），112.78（C－2′），148.58（C－3′），150.74（C－4′），114.32（C－5′），122.92（C－6′），165.08（C－7′），99.50（C－1″），73.00（C－2″），76.62（C－3″），70.05（C－4″），73.90（C－5″），63.94 （C－6″），99.05 （C－1″′），73.07 （C－2″′），77.05（C －3″′），69.47（C －4″′），76.82（C －5″′），60.19（C－6″′），55.58（OCH3），55.75（OCH3）。以上数据与文献报道基本一致[5]，鉴定该化合物为藏黄连酚苷A。

化合物Ⅳ：白色无定形粉末，ESI-MS m/z：633（M＋Na＋），609（M－H－），提示本品的分子量为 610。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.92（1H，d，J＝8.0Hz，H－2，6），7.10（1H，d，J＝8.0 Hz，H－3，5），2.47（1H，s，H－8），7.49（1H，brs，H－2′），7.12（1H，d，J＝8.0 Hz，H－5′），7.56 （1H，dd，J＝1.2，8.0 Hz，H－6′），5.12（1H，d，J＝7.2 Hz，H－1″），5.07（1H，d，J＝7.8 Hz，1″′），3.84 （1H，s，OCH3），3.18－5.01 为糖上质子 ；13CNMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：131.2（C－1），130.8（C－2，6），116.3（C－3，5），161.6（C－4），196.5（C－7），26.9（C－8），123.2（C－1′），112.8（C－2′），149.0（C－3′），151.2（C－4′），114.8（C－5′），123.3（C－6′），165.6（C－7′），56.2（OCH3），99.9（C－1″），73.5（C－2″），77.6（C－3″），70.2（C－4″），77.2（C－5″），63.5（C－6″），99.7（C－1″′），73.6（C－2″′），77.5（C－3″′），69.9（C－4″′），77.0（C－5″′），60.6（C－6″′）。以上数据与文献报道基本一致[5]，鉴定该化合物为藏黄连酚苷F。

化合物Ⅴ：白色针状结晶（丙酮），ESI-MS m/z：169（M＋H＋），167（M－H－），提示本品的分子量为 168。1H－NMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：7.45（1H，d，J＝1.6 Hz，H－2），6.84（1H，d，J＝8.4 Hz，H－5），7.45（1H，dd，J＝1.6，8.4 Hz，H－6），3.80（1H，s，OCH3）；13C－NMR（100 MHz，DMSO－d6）δ：122.3（C－1），115.7（C－2），151.7（C－3），147.9（C－4），113.4（C－5），124.1（C－6），167.9（C－7），56.2（OCH3）。以上数据与文献报道基本一致[4]，鉴定该化合物为香草酸。

化合物Ⅵ：白色针晶（甲醇），ESI－MS m/z：167（M＋H＋），165（M－H－），提示本品的分子量为 166。1HNMR（400 MHz，DMSO－d6）δ：δ7.11（1H，d，J＝1.6 Hz，H－2），δ6.14（1H，d，J＝8.4 Hz，H－5），δ7.29（1H，dd，J＝1.6，8.4 Hz，H－6），δ3.60（3H，s，OCH3），δ2.27（3H，s，H－8）。以上数据与文献报道基本一致[4]，鉴定该化合物为香草乙酮。

3 HPLC-ESI-MS检测

3.1 检测条件 仪器：Waters ACQUITY UPLC液质联用仪及紫外检测器，色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），预柱：Phenomenex,AJ0-4287，流动相：A为0.5%冰醋酸水相，B为乙腈相，进行梯度洗脱，梯度条件前6 min，A成线性由92%变到90%，随后6～12 min，A成线性由90%变到87%并保持该比例再洗脱3 min，随后的2 min内A成线性由87%变为82%，随后的3 min内A成线性由82%变为75%，在随后的5 min内A成线性由75%变为5%，最后1min内A由5%成线性变为92%；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；检测波长：275 nm。

质谱条件：用电喷雾离子化正离子采集模式（ESI＋），m/z范围：150～800 amu，毛细管电压 3.2 kV，用电喷雾离子化负离子采集模式（ESI－），m/z范围：150～800 amu，毛细管电压-2.8 kV，离子源温度：110℃，气化温度：350℃，脱溶剂气：700 L/h，锥孔反吹气50 L/h，锥孔电压：20 V。

3.2 样品处理 将胡黄连药材粉碎，称取5 g，用8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，过滤，合并提取液后减压回收制得浓度为生药1 g/mL胡黄连提取液。参考相关文献[6]，将上述药液以1 BV/h上样体积流量通过径高比1∶9的AB-8型大孔树脂，依次用水、20%、40%、60%及80%的乙醇洗脱各4柱体积，选取60%乙醇洗脱部分，蒸干称质量，精密加入50%甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，过0.45 μm微膜，滤液直接进入色谱分析系统分析，进样量为5 μL。

3.3 对照品溶液的制备 精密称取云杉苷、草夹竹桃苷、藏黄连酚苷A、藏黄连酚苷F、香草酸和香草乙酮对照品，精密加入50%的甲醇制成0.1 mg/mL的溶液，过0.45 μm微膜，滤液直接进入色谱分析系统分析，进样量为5 μL。

3.4 胡黄连药材UPLC-ESI-MS分析及含量测定 在本实验的色谱条件下，胡黄连中6个酚性成分获得了较为良好的基线分离。在总离子流色谱和紫外色谱中可以观察到该6个标记峰如图1，峰1的特征离子为 321，137（ESI＋），峰 2 的特征离子为 351,167（ESI＋），峰 3 的特征离子为 169（ESI＋），167（ESI－），峰 4 的特征离子为 167（ESI＋），165（ESI－），峰 5 的特征离子为633，313（ESI＋），峰6的特征离子为663，313（ESI＋）。图2为 6 个标记峰的质谱图。其中峰1的特征峰为分子离子峰321[M+Na]+，137[MGlucoside+H]；峰2的特征峰为分子离子峰351[M+Na]+，167[M－Glucoside+H]；峰 3 特征离子为分子离子峰169[M+H]+和167[M－H]-；峰4的特征峰为分子离子峰167[M+H]+和165[M－H]-；峰5的特征峰为分子离子峰 633[M+Na]+，313[M－Glucoside－香草乙酮碎片+H]；峰6的特征峰为分子离子峰663[M+Na]+，313[M－草夹竹桃苷+H]。以上6个酚类成分的含量结果见图1。

4 讨论

4.1 流动相的选择 在建立分析方法的过程中以乙腈、冰醋酸水为流动相，用等度方法无法同时分离上述6种物质，因此改成梯度淋洗方法。为得到较好的峰型，需要确定梯度下加酸的比例，经反复摸索，发现当加入0.5%的冰醋酸或0.05%的磷酸时效果最佳。但是磷酸为非挥发性酸，污染质谱检测器的离子源，因此选择向流动相中添加冰醋酸。

图1 胡黄连60%乙醇洗脱部分的UPLC-UV和UPLC-ESI-MS色谱图Fig.1 UPLC-UV and UPLC-ESI-MS chromatogram of Picrorhiza scrophulariiflora Pennell in 60%alcohol elution part

图2 化合物Ⅰ～Ⅵ的ESI+质谱图Fig.2 ESI+chromatogram of compoundsⅠ～Ⅵ

表1 化合物Ⅰ～Ⅵ的含量测定结果Tab.1 Results of assaying of compoundsⅠ～Ⅵ

4.2 质谱条件的优化 未来使各个物质都能达到最佳的质谱响应，优化的质谱条件包括溶剂气温度、离子源温度、毛细管电压、锥孔电压、脱溶剂气流速度。实验证明：脱溶剂气流速度、离子源温度、脱溶剂气温度对化合物的响应的影响比较小。锥孔电压是主要的影响因素，随着锥孔电压的升高，总离子流响应增强，分子离子峰的降低，当电压值达到20 V时，准分子离子峰达到最强。所以再选择离子模式时，锥孔电压设为20 V。

3.5.3 离子源电离模式的选择 分别采用正离子和负离子两种模式对上述化合物进行扫描，在正离子模式下，准分子离子峰均为[M+Na]+，在负离子模式下，准分子离子峰均为[M-H]-。但是正离子模式较负离子模式更灵敏，因此选择了正离子模式。

[1]中国药科大学.中药辞海[M].北京:中国医药科学技术出版社,1998:1311.

[2]汪 豪，叶文才，熊 非，等.西藏胡黄连的苯乙醇糖苷类化学成分研究[J].中国中药杂志，2004,29(6):531

[3]Li JX,Li P,TEZ UKA Y,et al.Three phenylethanoid glycosides and an iridoid glycoside from Picrorhiza scrophularii flora[J].Phytochemistry,1998,48(3):537.

[4]贺震旦，杨崇仁，王答祺，等.西藏胡黄连的化学成分[J].云南植物研究，1993,15(1):84.

[5]Huang SX,Liao X,Nie QJ.Phenyl and Phenylethyl Glycosides from Picrorhiza scrophulariiflora[J].Helvetica Chimica Acta,2004,87,598-605.