UPLC-UV法应用于丹红注射液多个活性成分的稳定性研究*

杨 静 ，刘海涛 ，王跃飞 ，朱 彦

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室（培育），天津 300193；2.天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心，天津 300457）

丹红注射液是由丹参、红花经科学配伍并采用现代制剂工艺制成的中药复方注射剂，具有活血化瘀、通脉活络的作用，临床上常用于预防治疗心绞痛、动脉粥样硬化等心脑血管疾病[1-2]。中药注射剂具有起效快、疗效可靠等优点，但由于中药注射液化学成分复杂，在其整个生产、储运和使用过程中化学成分会发生诸多变化，中药注射液的稳定性成为临床安全性问题的潜在隐患，是阻碍中药注射液广泛应用的主要问题之一。其工艺、物理、化学等方面的因素是影响中药注射液稳定性的主导因素，而中药注射剂的配伍使用问题也是其影响因素之一[3]。因此，本实验通过采用已建立的超高效液相色谱-紫外法（UPLC-UV）对丹红注射液中16个主要活性成分进行测定，研究丹红注射液在高温、强光照射，与5%葡萄糖注射液和0.9%氯化钠注射液配伍后活性成分的稳定性情况，为丹红注射液的储运和临床应用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters ACQUITY超高效液相色谱仪（四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、TUV检测器、MassLynx V4.1色谱工作站），Milli-Q超纯水系统（美国，Millipore公司），恒温恒湿箱Climacell 11222（德国，MMM 公司）。

1.2 试药 丹红注射液（批号：110420）由菏泽步长制药有限公司提供；腺苷（110879-200202）、尿苷（110887-200202）、苯丙氨酸（140676-200405）、5-羟甲基糠醛（111626-200906）、原儿茶酸（110809-200604）、原儿茶醛（110810-200506）、咖啡酸（110885-200102）、丹酚酸B（111562-201110）和羟基红黄色素A（111637-201106）购于中国食品药品检定研究院，胞苷、丹参素、紫丁香苷、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸C购于天津中新药业研究中心，其纯度≥98%；0.9%氯化钠注射液（山东华鲁制药有限公司，批号：B10120905），5%葡萄糖注射液（天津津兰药业有限公司，批号：10122202），乙腈、甲醇和甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；超纯水（Milli-Q 净化，0.22 μm 滤膜），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 影响因素实验 见参考文献[4]。

2.1.1 高温实验 随机取同批次的6支丹红注射液放入恒温恒湿箱中，于60℃温度下避光放置10 d，于第5天和第10天取样，分别测定其16个主要活性成分的含量。

2.1.2 强光照射实验 随机取同批次的6支丹红注射液放入装有日光灯的恒温恒湿箱中，于强度为（4500±500）lx的条件下放置10 d，于5 d和 10 d取样，分别测定其16个主要活性成分的含量。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别精密量取2.1.1和2.1.2项下的丹红注射液1 mL置于5 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容。取2 μL溶液注入UPLC，测定含量。

2.2 配伍稳定性实验 见参考文献[5]。

2.2.1 丹红注射液与氯化钠、葡萄糖注射液的配制按照丹红注射液说明书要求，在洁净条件下，取1 mL丹红注射液，分别用5 mL 0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液稀释。

2.2.2 光照、温度对配伍后溶液的影响 将2.2.1所得溶液密封放入恒温恒湿箱中，于25℃或37℃温度下避光或强度2500 lx条件下放置，于0、1、2、3、4 h取样。取0.6 mL溶液与0.2 mL甲醇混合后测定其含量。

2.3 色谱条件及方法学考察[6]

2.3.1 色谱条件 Agilent Zorbax RRHT SB-C18柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm），以 0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，0-2 min（97%A），2-5 min（97%A～96%A），5-6 min（96%A～93%A），6-13 min（93%A～88%A），13-15 min（88%A～86%A），15-29 min（86%A～79%A），29-31 min（79%A），31-34 min（79%A～75%A），34-37 min（75%A），37-42 min（75%A～64%A），42-45 min（64%A～50%A）；流速0.5 mL/min；柱温40℃；TUV检测器，检测波长为：核苷类成分260 nm、苯丙氨酸和紫丁香苷257 nm、酚酸类成分及5-羟甲基糠醛286 nm、羟基红花黄色素A 403 nm。色谱图见图1。

2.3.2 方法学考察 已建立的UPLC-UV法经过系统的方法学研究，能满足稳定性实验的要求。方法学考察包括线性关系（r≥0.999）、定量限（0.038～0.756 μg/mL）、检测限（0.011～0.227 μg/mL）、精密度（日内精密度、日间精密度RSD≤2.3%）、重复性（RSD≤2.0%）、稳定性（4℃下8 h稳定）和加样回收率实验（91.47%～108.46%，RSD≤3.1%）。

2.4 稳定性实验结果

2.4.1 影响因素实验结果影响因素的实验目的是探讨药物的固有稳定性、了解影响其稳定性的因素及可能的讲解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件和建立降解产物分析方法提供科学依据。

以丹红注射液中各成分的含量为参照（即稳定性研究中0 d的测定结果），计算不同采样时间样品各成分相对于0 d测定结果的相对百分比，结果见表1。5-羟甲基糠醛、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C的含量在强光照射下有明显降低，其中丹酚酸A降低最明显。5-羟甲基糠醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C的含量在高温下明显降低，其中丹酚酸C降低最明显，而紫草酸含量明显升高。在高温条件下丹红注射液中紫草酸升高的原因主要是丹酚酸B在高温下其酯键水解脱去一分子丹参素后形成紫草酸，如图2所示，与文献报道一致[7]。

2.4.2 配伍稳定性实验结果本实验考察了丹红注射液与不同注射液混合（5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射液）（1∶5）后16个活性成分含量变化情况，并模拟临床用药条件（温度：25°C和37℃；光照：光照射和避光）对其配伍后样品稳定性做进一步的深入研究，为合理临床用药提供依据。

丹红注射液与5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射液（1∶5）混合后0 h丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C的含量均有明显降低，并且与0.9%氯化钠注射液混合后上述成分下降更明显；丹红注射液与5%葡萄糖注射液混合后5-羟甲基糠醛含量明显升高，原因为5%葡萄糖注射液中含有一定量的5-羟甲基糠醛，结果见图3；其他成分含量未发生变化。在不同温度和光照条件下，在4 h内丹酚酸B等14个成分的含量不随时间延长而变化；丹酚酸A随着时间延长不断降低；丹酚酸C随着时间延长不断升高。丹酚酸A和C相反的变化趋势不同是由于丹酚酸A的酚羟基和双键发生氧化环合反应生成丹酚酸C，这一现象与Xu等[8]的报道一致。不同光照条件（光照或避光）下丹酚酸A或C的变化趋势一致。不同温度下，丹红注射液与5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射液混合后在37℃下丹酚酸A和C变化更明显。研究结果见图4。

表1 在高温、强光照射下丹红注射液16种主要成分的含量变化情况Tab.1 Change of 16 main components in Danhong injection under high temperature or strong lighting %

3 讨论

高温和强光照射都会影响丹红注射液中化学成分的稳定性，其中酚酸类化合物对热和光均不稳定，而酚酸类成分是丹红注射液的主要有效成分，具有抗氧化、抗血小板聚集、抑制血栓形成等作用。因此在丹红注射液的贮存和运输过程中要尽量避免高温和强光照射。

葡萄糖注射液中含有一定量的5-羟甲基糠醛，当其与丹红注射液配伍后使5-羟甲基糠醛含量进一步升高。因5-羟甲基糠醛具有致敏性，中华人民共和国药典2010版对其在葡萄糖注射液中有明确的限量规定。因此，从本实验结果分析，在丹红注射液的临床应用中，在条件允许的情况下应首选0.9%氯化钠注射液和丹红注射液混合使用，减少因5-羟甲基糠醛导致的临床不良反应的发生。

[1]魏艳阳，周明银.丹红注射液治疗冠心病不稳定型心绞痛临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2009，7（1）：95－96.

[2]卢军利，朱爱华，董 艳，等.丹红注射液对冠心病患者血管内皮依赖性扩张功能的影响[J].中国医药导刊，2008，10（5）：708－709.

[3]黄江虹.影响中药注射剂稳定性的相关因素研究[J].时珍国医国药，2007，18（5）：1271－1272.

[4]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京:中国医药科技出版社，2010：附录199-201.

[5]王 冰，朱薇婕，曾晓丽，等.丹参冻干粉针中丹酚酸B稳定性研究[J].中成药，2007，29（10）：1479－1482.

[6]Liu HT,Wang YF,Olaleye Olajide,et al.Characterization of in vivo antioxidant constituents and dual-standard quality assessment of Danhong injection[J].Biomedical chromatogr,DOI 10.1002/bmc.2842.

[7]Zheng XT,Qu HB.Characterisation of the degradation of salvianolic acid B using an on-line spectroscopic analysis system and multivariate curve resolution[J].Phytochem Anal,2012,23(2):103-109.

[8]Xu JZ,Zeng SH,Chen XY,et al.Isolation and identification of degradation products of salvianolic acid A by NMR and LC-MS[J].Fitoterapia,2011,82(2):260-266.