紫花地丁总黄酮和多糖对D-半乳糖致衰小鼠血清中过氧化氢酶活性的影响*

段建荣，严贵亮

（河北省张家口市沙岭子医院药剂科，张家口 075000）

紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁（Viola yedoensis Makino）的全草。中国各地均有生长。紫花地丁具有清热解毒，凉血消肿的功效，主治黄疸、痢疾、乳腺炎、目赤肿痛、咽炎；外敷治跌打损伤、痈肿、毒蛇咬伤等。含有为黄酮、多糖、香豆素、挥发油等成分[1-2]。笔者对紫花地丁总黄酮及多糖进行了提取，并研究了总黄酮和多糖对D-半乳糖致衰小鼠血清中过氧化氢酶活性的影响。

1 材料

1.1 仪器 U-3900紫外可见分光光度计（日本日立仪器有限公司），KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），MP1100B型电子天平（上海精科天平仪器厂），高速冷冻离心机（Sigma Microelectronics Co.Ltd）。

1.2 试剂与药品 药材紫花地丁采自河北张家口，由张家口市第一医院中医科主任，郑秀英教授鉴定为紫花地丁（Viola yedoensis Makino），D-半乳糖(分析纯，上海试一化学试剂有限公司)，过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（由南京建成生物工程研究所提供），其他试剂均为国产分析纯，实验用水为去离子水。

1.3 实验动物 健康的昆明种小鼠120只（雌雄各半），购买于河北北方学院实验动物中心，分笼饲养，室温18～25℃，空气新鲜，通风良好，自由摄食、饮水。

2 方法与结果

2.1 紫花地丁总黄酮的提取 紫花地丁粉碎后置于60℃干燥箱中恒温干燥24 h，称取一定量的紫花地丁粉末，用70%乙醇恒温浸提，提取液加4%NaOH溶液萃取，18%HCl液酸化NaOH液，乙酸乙酯萃取，减压蒸干乙酸乙酯，加乙醇溶解，制成浓度为1mL/g紫花地丁药材的总黄酮溶液。

2.2 紫花地丁总黄酮的含量测定[3]准确称取芦丁对照品10.0 mg置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解定容作为母液，从母液中精密量取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 分别置于 25 mL 容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，用70%乙醇作为空白对照，在510 nm波长处测吸光度值。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准曲线方程为A=1.181 0x-0.ue=1，r=0.9990。根据标准曲线求得紫花地丁总黄酮含量。按下式计算总黄酮得率为0.9032%。

2.3 紫花地丁多糖的提取[4]称取一定量的紫花地丁粉末，经95%乙醇浸提3次，药渣置室温干燥。称取一定量药渣，加入10倍量的蒸馏水，煎煮2 h，滤过，加入4倍体积的无水乙醇，搅匀，静置过夜，抽滤，所得沉淀依次用适量无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，置干燥箱中干燥，称质量。精密称取多糖适量，加水溶解，制成浓度为1mL/g紫花地丁药材的多糖溶液。

2.4 紫花地丁多糖的含量测定[5]精密称取105℃干燥至恒质量的葡萄糖100 mg，置100 mL的容量瓶中，加水溶解定容，摇匀，配成葡萄糖标准溶液。精密量取葡萄糖标准溶液适量，分别加水稀释制成0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL 的溶液，摇匀。分别精密吸取上述不同浓度溶液1.0 mL，置锥形瓶中，加入1.0 mL苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，立即摇匀，室温放置30 min，平行空白，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为A=9.956 9C+0.ue=1，r=09992。根据标准曲线求得紫花地丁多糖浓度。按下式计算多糖得率为13.56%。

2.5 紫花地丁总黄酮和多糖对D-半乳糖致衰小鼠血清中CAT活性的影响

2.5.1 供试溶液的制备 量取适“2.1紫花地丁总黄酮的提取”项下制备的总黄酮溶液，减压蒸干乙醇后，加适量水制备为浓度为0.4 mg/mL的溶液。作为总黄酮供试溶液。量取“2.3紫花地丁多糖的提取”项下制备的多糖溶液，加水稀释至浓度为0.4 mg/mL作为多糖供试溶液。

2.5.2 动物造模给药 健康的昆明种小鼠80只（雌雄各半），采用随机数字表法随机分为空白对照组、模型对照组、紫花地丁总黄酮高、中、低剂量组、紫花地丁多糖高、中、低剂量组，适应性饲养一周后雌雄分开。

小鼠腹腔注射D-半乳糖[200 mg/（kg·d）]，制备亚急性衰老模型[6]。空白对照组注射等体积生理盐水。各治疗组从第9周开始每日上午分别灌胃给药，空白对照组和模型对照组给等体积的生理盐水，紫花地丁总黄酮、多糖高剂量组40 mg/kg，紫花地丁总黄酮、多糖中剂量组20 mg/kg，紫花地丁总黄酮、多糖低剂量组10 mg/kg，连续8周。

2.5.3 取材与检测[7-8]末次给药后，小鼠断头取血，以4000 r/min离心10 min，取血清，按试剂盒说明，检测CAT活力。结果见表1。

2.5.4 统计学处理 实验数据采用SPSS18.0统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 紫花地丁总黄酮和多糖对D-半乳糖致衰小鼠血清中过氧化氢酶的活性的影响（±s）Tab.1 Effects of Flavonoid and Polysaccharides in Viola yedoensis Makino on serum CAT in D-galactose induced aging mouse（±s）

表1 紫花地丁总黄酮和多糖对D-半乳糖致衰小鼠血清中过氧化氢酶的活性的影响（±s）Tab.1 Effects of Flavonoid and Polysaccharides in Viola yedoensis Makino on serum CAT in D-galactose induced aging mouse（±s）

注：与模型组比较，▲P＜0.05，△P＜0.01。

组别 剂量（mg/kg）n CAT（U/mL）空白组 01072.15±16.42△模型组 01036.38±10.54总黄酮组 401061.28±13.56△201057.47±11.24△101048.39±12.75▲多糖组 401056.20±13.91△201048.34±10.27▲101042.15±11.20▲

3 讨论

D-半乳糖所致的亚急性衰老模型，是细胞内糖代谢紊乱，导致机体抗氧化防御系统破坏，大量的自由基积聚，过氧化脂质、脂褐质等增高，导致拟衰老变化，是一种较为理想的模型。已经广泛应用于衰老机制、老年疾病、抗衰老药物筛选等方面的研究[9-10]。

实验结果表明模型对照组的CAT活力显著低于正常对照组（P＜0.05）；各治疗组的CAT含量明显高于模型对照组（P＜0.05）。

紫花地丁总黄酮中、低剂量组提高小鼠血清CAT的活力的作用强于紫花地丁多糖中、低剂量组（P＜0.05），两者高剂量组之间差异无统计学意义。

本实验结果表明，紫花地丁总黄酮和多糖可提高机体内CAT的活性，消除体内过多的自由基，从而阻断自由基对机体的破坏，产生延缓和预防衰老的作用。

[1]陈胡兰，董小萍，张 梅，等.紫花地丁化学成分研究[J].中草药，2006，41（6）：874-878.

[2]肖永庆，毕俊英，刘晓宏，等.地丁化学成分的研究[J].植物学报，1987，29（5）：542-536.

[3]李喜凤，郝 哲，杜云锋.蒲公英中总黄酮提取工艺的研究[J].时珍国医国药，2009，20（7）：1695-1696.

[4]刘万水.马齿苋多糖的提取与精制[J].天津中医学院学报，2002，21（4）：39.

[5]杨 辉，李秀荣.不同产地桃叶鸦葱多糖的含量测定[J].河南工业大学学报（自然科学版），2010，31（5）：59-61.

[6]张石宁，陈 明，肖 红.D-半乳糖致衰老模型的研究[J].临床精神医学杂志，1998，8（6）：327-328.

[7]于 涛，于建春，陆明霞.针刺对快速老化小鼠SAMP10氧化应激相关基因表达的影响[J].天津中医药，2004，21（4）：281-284.

[8]王 筠，张军平.中药血清药理学实验方法研究概况[J].天津中医药，2005，22（1）：86-88.

[9]刘洪涛，柴 霞，郭永祥.补肾方对亚急性衰老大鼠模型总抗氧化力影响的实验研究[J].天津中医药，2008，25（5）：404-405.

[10]徐军娟.中医药用于抗衰防病的体会[J].天津中医药大学学报，2002，19（3）：18.