RP-HPLC法测定不同溶剂和缓冲溶液中羟基喜树碱的溶解度

2012-11-27 08:23蒲晓辉秦一萌何仲贵
河南大学学报(医学版) 2012年1期
关键词:喜树碱液相色谱仪缓冲溶液

蒲晓辉,孙 进,秦一萌,廉 鹤,何仲贵*

(1.河南大学药学院 药物分析教研室,河南 开封475004;2.沈阳药科大学 药学院,辽宁 沈阳110016)

羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin,HCPT)是中国特有珙桐科旱莲属落叶植物喜树(Camptotheca acuminata)中含有的一种生物碱。上世纪六十年代,Wall等[1]首先从喜树中分离出具有抗肿瘤活性的喜树碱(Camptothecin,CPT)和 HCPT。20世纪70年代初期,CPT以水溶性钠盐的形式进入临床研究,对肝癌、胃癌、膀胱癌及白血病有较好的近期疗效,但因伴有严重的副作用(消化道反应,血尿,白细胞及血小板减少)使得Ⅱ期临床无法继续。1980年,Wall[2]在“喜树碱的结构和活性的关系”中,肯定了HCPT是所有天然存在或合成的CPT类似物中活性最高的,而毒性比CPT低。喜树碱类药物的抗肿瘤活性主要通过作用于Topo I,抑制DNA的复制和转录,进而使细胞出现程序性凋亡和死亡。癌细胞中Topo I含量比正常细胞高得多,Topo I更易受到抑制,从而可以达到杀死癌细胞的目的[3-6]。HCPT是一种由五个环组成的化合物,其中有一端为六元环内酯,此内脂环的20(S)比20(R)抗癌活性大10~100倍,但该内酯环遇碱不稳定,易水解开环,抗癌活性降低。HCPT没有明显的碱性,属于中性生物碱,不溶于酸,遇酸不易成盐,不溶于水,难溶于脂,微溶于无水乙醇、甲醇,可溶于碱、吡啶、二甲亚砜、氯仿-甲醇混合液等有机溶剂。

我们建立了适用于羟基喜树碱理化性质研究的高效液相分析方法,首次对羟基喜树碱在不同溶剂和不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中的溶解度进行了考察,为羟基喜树碱新型制剂的处方设计、工艺研究和稳定性考察提供了参考。

1 试药与仪器

1.1 试药

羟基喜树碱(湖北黄石飞云制药,纯度>99%);甲醇(色谱纯,天津康科德化学试剂厂);其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

紫外分光光度仪(UV-1801,日本岛津公司);高效液相色谱仪 (L-7000,日本Hitachi公司,带有自动进样器、紫外检测器);电子分析天平(FA2104,上海精密科学仪器有限公司);PHS-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂);HZQ-C空气浴振荡机(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂);XW-80A涡旋混合器(上海精科实业有限公司)。

2 实验方法和结果

2.1 HCPT体外分析方法的建立和确证

2.1.1 检测波长的选择 取一定质量浓度的HCPT标准溶液(溶剂为甲醇),以甲醇作为空白对照,于200~400nm波长范围内扫描,结果见图1。由图可见,HCPT在266nm和384nm波长有最大吸收。为了避开末端吸收的影响,我们选择384nm作为检测波长。

2.1.2 色 谱 条 件[7-9]色 谱 柱:Diamonmsil-C18(4.6mm×200mm,5μm);流动相:甲醇-0.1mol/L磷酸盐缓冲液(60∶40),pH=5.0;检测波长:384nm;流速:1.0mL/min;柱温35℃;进样量:20μL。

图1 HCPT紫外扫描图

2.1.3 系统适用性实验 取一定质量浓度的HCPT标准溶液,以20μL注入液相色谱仪,记录色谱图,见图2。实验结果表明,在“2.1.2”项的色谱条件下,HCPT峰拖尾因子为1.272,分离度=2.024>1.5,色谱柱理论塔板数按HCPT计算不少于3 000。

2.1.4 HCPT内酯型和羧酸盐型色谱峰分离 取一定质量浓度的HCPT标准溶液置25mL量瓶中,用pH6.0的磷酸盐缓冲溶液定容至刻度,取20μL注入高效液相色谱仪,记录色谱峰,可见HCPT的内酯型和羧酸盐型的2种形式可以通过HPLC有效地分离,见图3。

图3 内脂环和羧酸盐形式的HPLC色谱图Ⅰ:羧酸盐;Ⅱ:内脂环。

2.1.5 标准曲线的制备 取HCPT原药2.53mg,精密称量,置100mL棕色量瓶中,用适量甲醇溶解并稀释定容至刻度,摇匀,得储备液。精密量取10mL储备液至25mL量瓶中,用适量甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得质量浓度为10.12mg/L的标准溶液。分别精密量取该标准溶液适量,置于10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,得到0.050 6、0.101 2、0.202 4、0.506 0、1.012 0、2.024 0mg/L的标准系列溶液,分别吸取各标准溶液20μL注入高效液相色谱仪,记录峰面积。以HCPT质量浓度X(mg/L)为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线性回归,得HCPT的线性回归方程为:Y=9 583.7 X+368.3,r2=0.999 9。结果表明,在0.050 6~10.120 0mg/L范围内HCPT质量浓度和峰面积呈良好的线性相关性,标准曲线见图4。

图4 HCPT的标准曲线图

2.1.6 精密度实验 取质量浓度为1.012mg/L的HCPT标准溶液5份,分别在日内和日间重复测定,考察精密度,结果见表1。

表1 HCPT的精密度实验结果(n=5)

2.1.7 回收率实验 精密量取空白纳米混悬液1mL,加入HCPT储备液适量,用甲醇稀释至质量浓度分别为0.1、1、5mg/L,进样测定峰面积,按标准曲线计算回收率,结果见表2。

表2 HCPT的回收率实验结果(n=5)

2.2 HCPT在不同溶剂中的平衡溶解度测定

根据不同制备工艺的要求,选择低毒性的有机溶剂作为溶剂,测定平衡溶解度。各种溶剂分别取2mL置于10mL具塞玻璃试管中,然后加入过量的HCPT,置水浴恒温振荡器中,在25℃、150次/min的条件下,振荡72h,离心,取上清液1mL,用适量的流动相稀释,以“2.1.2”项下的色谱条件,取各溶液20μL注入高效液相色谱仪,记录峰面积[10]。由回归方程计算浓度,并求算HCPT的平衡溶解度,结果见表3。

2.3 HCPT在不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度

HCPT在其水溶液中以闭环的内酯和开环的羧酸盐2种形式共存,二者之间存在着一个pH值依赖的平衡关系,随着碱性的增强,闭环的内酯转向开环的羧酸盐,见图5。HCPT内酯形式在水中的溶解度远小于羧酸盐形式,因此,随着pH值的变化,2种形式在水中溶解度的总和也随着变化。这一性质不仅影响着制备工艺的选择,而且也影响到药物在胃肠道内的吸收和转运,进一步影响药物的疗效。所以,研究HCPT在不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度,可以为制备工艺的选择和处方设计提供依据。

表3 HCPT在不同溶剂中的平衡溶解度

图5 HCPT的内酯环和羧酸盐形式的互变方程式

取2mL不同pH值缓冲溶液各3份,置于10mL具塞玻璃试管中,然后加入过量的HCPT,置于水浴恒温振荡器中,在25℃、150次/min的条件下,振荡72h,然后经15 000r/min离心10min,上清液经0.1μm膜滤过,取续滤液0.5mL,用适量的体积分数为0.1%的醋酸甲醇溶液稀释,以“2.1.2”项下的色谱条件,取各溶液20μL注入高效液相色谱仪,记录峰面积[10]。由回归方程计算质量浓度,进一步计算HCPT的平衡溶解度,结果见表4。

表4 HCPT在不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度

3 讨论

经绘制紫外可见吸收图谱,HCPT在266nm和384nm波长有最大吸收,且吸收强度接近。由于很多溶剂和辅料在200nm左右有明显吸收,从而形成末端吸收,因此,对最大吸收在200nm附近的药物的测定可能会产生干扰。为了避开末端吸收的影响,文中我们选择384nm作为检测波长,这与大多数文献报道[11-13]的结果相一致。

在含 量 测 定 中,曾 选 用 流 动 相[7-9,14-16]:乙 腈-75mmol/L醋酸铵缓冲液 (30∶70),含三乙胺5mmol/L,冰醋酸调pH 至6.4;乙腈-水(25∶75);乙腈-75mmol/L醋酸铵缓冲溶液(25∶75),含三乙胺5mmol/L,冰醋酸调pH 至5.6;甲醇-0.1mol/L磷酸盐缓冲液(60∶40),调pH至5.0。结果表明,前3种流动相都使HCPT的色谱峰略有前延,且使HCPT的信号响应值变小,这可能是因为HCPT遇到偏碱性流动相会部分开环,使极性增加,保留时间变短,同时使峰面积变小,从而影响含量测定的准确度。

根据试验结果可知,HCPT在大多数有机溶剂和缓冲溶液中的平衡溶解度都很低,表明HCPT的水溶性和脂溶性均较差,这可归因于HCPT的高熔点、低logP值,此类物质属于砖灰型成分,分子间作用力强,结晶能高。而药物溶出过程中涉及的活化能是影响药物溶出的一个重要因素,对于结晶形式的药物,只有溶解能超过其活化能(即晶格能)时,药物才能溶出,因此,像HCPT这样的高熔点、低logP值的药物一般平衡溶解度低,属于不溶于水,难溶于脂类化合物。

HCPT的化学结构中存在1个羟基和1个内酯环,在其水溶液中以闭环的内酯和开环的羧酸盐2种形式共存。在强碱环境下,内酯环都可能开环转向羧酸盐形式,其平衡溶解度随着pH值的变化而变化。根据不同pH值缓冲溶液中的HCPT平衡溶解度的测定结果可知,HCPT的平衡溶解度基本上随着碱性的增强而提高,在pH 3.0时平衡溶解度最低,pH1.2时HCPT的平衡溶解度比pH 5.0、pH 6.0、pH 6.8时要高,从这一点我们可以推测,当HCPT在胃中达到饱和时,进入肠道后可能会因过饱和而沉淀析出[17]。所以,不同pH值缓冲溶液中的HCPT平衡溶解度的测定结果,为我们设计HCPT口服制剂的处方和工艺提供了有力的依据。

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