杏鲍菇多糖对衰老模型小鼠学习记忆能力和脑组织抗氧化能力的影响①

姚冰薇，顾正峰，许波，李丹，练维，盛伟

杏鲍菇，别名刺芹侧耳，学名Pleurotus eryngii(DC exFr.)Quel.，属口蘑科，侧耳属。1970年，Henda在印度北部克什米尔高山上发现杏鲍菇；1974年，Cailleux用菌褶分离法获得杏鲍菇菌株并试栽成功；1977年，Ferri首先进行商业性栽培[1]。杏鲍菇是一种很有发展前景的新型食用菌，也是联合国世界粮农组织向世界各国推荐的食用菌新品。现代药理学研究表明，杏鲍菇中所含的真菌多糖能增强机体免疫功能，具有抗病毒作用，且能降低机体胆固醇含量，防止动脉硬化[2]。杏鲍菇子实体入药有降血压、血脂的功效，其多糖含量丰富，与双歧杆菌结合有改善肠胃功能和美容效果，多糖还具有抗癌效果。

杨立红等报道杏鲍菇多糖对小鼠肝脏、骨骼肌有明显的抗氧化、抗损伤作用[3]。张俊会等研究显示，杏鲍菇多糖对自由基引起的亚油酸、菜油氧化以及离体肝脏组织的脂质过氧化均有一定的抑制作用[4]。本课题在杏鲍菇多糖体外抗氧化活性基础上，利用D-半乳糖所致衰老小鼠模型，研究杏鲍菇多糖体内抗衰老与防治神经退行性变的生理活性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年ICR小鼠，雌雄各半，体重18～20 g，由南通大学实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂 杏鲍菇菌株：安徽科技学院生命科学学院真菌研究所提供；脑复康片：扬州市星斗药业有限公司(批号：120931)；D-半乳糖：上海生工生物工程有限公司进口分装；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 杏鲍菇多糖的提取[5]杏鲍菇液体深层发酵培养，将发酵获得的菌丝体烘干后粉碎，过40目筛得菌丝体干粉；加入15倍体积的蒸馏水，沸水浸提2 h，离心过滤，重复2次，合并上清提取液；提取液浓缩后用终浓度为75%乙醇沉淀24 h。离心后，将沉淀物用蒸馏水溶解，Sevag法除蛋白，浓缩醇析沉淀2次；乙醇洗涤2次，真空干燥，得杏鲍菇多糖制品。

1.3.2 衰老小鼠模型的建立[6]ICR小鼠72只，雌雄各半，分为6组：①低剂量组；②中剂量组；③高剂量组；④脑复康组；⑤模型组；⑥对照组。每组12只。①、②、③、④、⑤组小鼠颈背部皮下注射5%D-半乳糖0.25 ml/10 g，连续注射6周；其中①、②、③、④组小鼠于第3周分别灌胃给予杏鲍菇多糖2 g/kg、3 g/kg、6 g/kg及脑复康6.2 mg/10 g，⑤组小鼠给予等量双蒸水；⑥组小鼠颈背部皮下注射等量生理盐水并于第3周给予等量双蒸水。

1.3.3 Y型迷宫测试[7]Y型迷宫为3等分辐射式反射箱。以小鼠被电击后逃至安全区为正确反应，连续10次测试中有9次正确反应，定为学会。记录各组小鼠达到学会标准的训练次数。

1.3.4 器官指数测定 6周末将小鼠脱臼处死，取出心、肝、肾、脑，生理盐水洗净残留血液后精确称重，按公式计算脏器指数：

1.3.5 大脑SOD活性及MDA含量测定 取大脑组织，加入适量组织匀浆液，冰浴匀浆。Bradford法测定总蛋白含量。取1%大脑组织匀浆，用黄嘌呤氧化酶法(SOD检测试剂盒)于波长550 nm处测定小鼠大脑组织匀浆的吸光度值。TBA比色法(MDA检测试剂盒)于波长532 nm处测定小鼠大脑组织匀浆液的吸光度值。

1.3.6 大脑脂褐质含量测定 用Sohal法。称取小鼠脑组织100 mg，加入氯仿、甲醇(2∶1)提取液2 ml，充分磨成匀浆，滤纸过滤，加提取液至5 ml，紫外线照30 s，于荧光分光光度计上测定其荧光强度值(发射波长435 nm，激发波长365 nm)。计算脂褐质含量：

1.3.7 大脑谷氨酸含量测定 称取小鼠脑组织100 mg，0.61 mol/L三氯乙酸制作10%匀浆，取上清，石油醚-正丁醇洗后，点样，电泳，茚三酮显色后用双波长薄层扫描仪测定全脑谷氨酸的含量。

1.4 统计学分析 采用Stata 11.0统计分析软件对各实验组与对照组间的差异进行t检验。

2 结果

2.1 Y型迷宫 与对照组相比，模型组小鼠达到学会标准训练次数显著增加(P＜0.001)；中、高剂量组训练次数低于模型组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组Y型迷宫训练次数比较

2.2 器官指数 模型组肝、脑、肾的器官指数均较对照组显著降低(P＜0.001)。高剂量组脑、肾器官指数较模型组升高(P＜0.05)。见表2。

表2 各组器官指数比较(mg/g)

2.3 SOD、MDA、脂褐质、谷氨酸 与对照组相比，模型组大脑组织SOD的活性明显降低(P＜0.01)，MDA、脂褐质、谷氨酸含量明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，中、高剂量组SOD活性增加(P＜0.05)、MDA、脂褐质含量降低(P＜0.05)；高剂量组谷氨酸含量下降(P＜0.05)。见表3。

表3 各组SOD、MDA、脂褐质、谷氨酸比较

3 讨论

D-半乳糖致衰老模型是基于衰老的代谢学说而复制的一种衰老模型，具有与自然衰老相似的自由基代谢紊乱特征，衰老反应接近于自然衰老[8]。

衰老过程中，全身组织器官逐渐萎缩，其中脑和肾脏的质量减轻最为显著[9]。器官指数是反映生物体衰老程度的重要指标之一[10]。本研究显示，模型组小鼠除心脏指数外，肝、脑和肾脏指数均比对照组显著降低，高剂量杏鲍菇多糖能减轻脑和肾质量的增龄性下降，延缓脑、肾衰老过程。

D-半乳糖可在体内氧化产生大量自由基，引起脂质过氧化，导致细胞膜损伤；过氧化脂质(LPO)的分解终产物如MDA可与DNA或RNA及蛋白质和磷脂有关结构结合，使细胞膜结构改变，促进衰老；MDA等还可通过交联、结合形成脂褐质，导致神经系统的障碍。SOD在保护心脑功能、延缓衰老方面具有重要的作用，SOD活性与物种寿命呈正相关。本研究显示，模型组学习记忆力下降，大脑SOD活力降低，MDA含量升高，表现出明显的衰老特征[11]。脂褐素沉积是衰老的一种标志，沉积程度与脂质过氧化反应正相关。脂褐素主要积累在大脑皮层和海马，可破坏细胞磷脂膜结构，导致线粒体和粗面内质网减少以及空泡形成等，并使神经元数目减少，产生拟衰老变化[12]。

谷氨酸是中枢神经系统中一种重要的神经递质。自然衰老动物脑中，谷氨酸含量增加，持续激活N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体，使细胞外Ca2+内流，细胞内Ca2+超载，产生大量的自由基，导致神经系统损伤。Poeggeler认为，谷氨酸的增多与衰老有密切联系，其机制大致可概括：谷氨酸-自由基-衰老[13]。

盛伟等报道，杏鲍菇多糖提取物有较强的体外抗氧化性能，随着浓度的增大其抗氧化作用亦增大[14]。对羟基自由基及超氧阴离子自由基的清除能力较强。

杏鲍菇是深受市场欢迎的食药用真菌，对其真菌多糖的研究是目前杏鲍菇研究的重点。本研究显示，杏鲍菇多糖能够有效对抗D-半乳糖所致的小鼠亚急性脏器衰老和学习记忆能力的降低；机制可能是通过提高机体SOD等抗氧化酶活力，减少兴奋性神经递质谷氨酸的含量，从而对抗自由基对细胞的损伤，降低MDA、脂褐质等代谢产物的产生。

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