雷竹林存留有机覆盖物高效降解菌株分离及产酶条件优化

可 晓，陈双林，张小平，郭子武

(1.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 富阳，311400；2.四川农业大学 资源与环境学院，四川 雅安 625014)

雷竹Phyllostachys violascens林地有机材料(主要为砻糠、稻草、锯木屑等)覆盖竹笋早出技术的推广应用始于20世纪90年代初，满足了市场供应淡季对鲜笋的大量需求，显著地提高了笋用竹林的经济效益[1]。然而，长期连年覆盖会导致雷竹林地土壤理化性质劣变，竹林地上和地下部分结构失衡[2－6]，致使雷竹林大面积衰败，如雷竹笋用竹主产区浙江省临安市太湖源镇超过1万hm2雷竹林中重度、中度、轻度退化竹林所占比例分别达13.34%，26.66%和46.67%，未退化竹林仅占13.33%，重度退化竹林几乎无经济产出[7]。而存留于雷竹林土壤中短期内难以自然腐解且高碳氮比 (C/N)，富含纤维素和木质素的有机覆盖物，是导致林地土壤发生物理、化学和生物性劣变重要原因之一。因此，从维护林地覆盖笋用竹林高效可持续经营目标出发，必须采取高效、无二次污染的林地存留有机覆盖物促腐措施。目前，具有生物质材料降解活性的微生物已广泛应用于高碳氮比材料的工业发酵(替代能源的生产)[8]、饲料生产[9]和秸秆还田土壤培肥[10]等方面，而对于笋用竹林存留有机覆盖物降解微生物筛选、降解活性及产酶条件的相关研究尚未见有报道。本研究从长期堆放有机覆盖物场所的不同腐解程度的稻草、砻糠及覆盖雷竹林土壤中筛选培养具有高纤维素降解酶活性的微生物，并对其产酶条件进行优化，旨在为笋用竹林林地存留有机覆盖物高效促腐制剂的研制提供前期理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料采自浙江省临安市太湖源镇(30°24′N，119°32′E)雷竹林林地覆盖的不同腐解程度的砻糠、稻草及覆盖雷竹林土壤。砻糠、稻草采用多点取样法，取混合样品200.00 g，土壤采用五点取样法，取0～10 cm土壤混合样品500.00 g。样品采集后放入无菌袋内，置于冰壶中带回实验室4℃保存。

对照菌株哈茨木霉(HC)Trichoderma harzianum，绿色木霉(LS)Trichoderma viride购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 培养基

富集培养基(赫奇逊滤纸液体培养基):1 cm×6 cm新华定量滤纸、磷酸二氢钾(KH2PO4)1.00 g，氯化钠(NaCl) 0.10 g，硫酸锰(MgSO4°7H2O) 0.30 g，硝酸钠(NaNO3) 2.50 g，氯化铁(FeCl3) 0.01 g，氯化钙(CaCl2) 0.10 g。水 1 000 mL，pH 7.2[11]。

初筛培养基(刚果红羧甲基纤维素平板培养基):羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2.00 g，刚果红0.40 g，硫酸铵[(NH4)2SO4]2.00 g，硫酸锰(MgSO4°7H2O) 0.50 g，磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.00 g，氯化钠(NaCl)0.50 g，琼脂20.00 g。水1 000 mL，自然pH值(不进行人为的调节)[12]。

复筛培养基(赫奇逊秸秆液体培养基):用稻草取代富集培养基中的滤纸。

1.3 菌株筛选

分别取腐烂的砻糠、稻草及雷竹林土壤样品各10.00 g，加入装有90.0 mL无菌水和玻璃珠的150.0 mL三角瓶中，180 r°min－1振荡30 min使样品充分分散，取悬浊液5.0 mL接种于45.0 mL富集培养基中，28℃下120 r°min－1振荡培养2 d。再取培养液接种到新鲜无菌富集培养基中，反复培养3次。

取第3次富集培养液100 μL均匀涂布在刚果红羧甲基纤维素平板培养基上，28℃下培养，挑取水解圈出现时间早，水解圈直径与菌落直径之比大的菌株进行纯化并保存。将初筛获得的菌株分别在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)(真菌)、高氏一号(放线菌)培养基上活化，用直径1 cm打孔器在菌落生长均匀处取菌块接种于复筛培养基中，28℃下120 r°min－1振荡培养5 d，测定发酵液中滤纸酶活力，筛选具有高纤维素酶活性的菌株。

1.4 滤纸酶(filter paper activity，FPA)活力测定

滤纸酶活力测定采用 3，5-二硝基水杨酸显色法[13－16]。发酵液于 10 kg°min－1离心 10 min，取上清液即为粗酶液。将新华定量滤纸裁剪成1 cm×6 cm的小条，放入25.0 mL刻度试管中，加入1.0 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)和稀释酶液0.5 mL，50℃水浴中反应1 h，加入3.0 mL 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂沸水浴5 min，定容到25.0 mL后测定540 nm波长吸光度，计算还原糖量，同时测定发酵液中的还原糖量，以酶解反应液中还原糖量与发酵液中还原糖量之差计算酶活力。实验设3个重复。以1 h 1.0 mL原酶液催化底物(滤纸)转化为1 μmol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位(16.67 nkat)。

1.5 产酶条件优化

1.5.1 单因素实验 采用赫奇逊液体培养基。选择不同培养时间(1，2，3，4，5，6，7 d)，pH(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)，培养温度(20，25，30，35，40℃)，碳源[淀粉、 葡萄糖、 微晶纤维素粉、稻草秸秆粉、淀粉和微晶纤维素粉(m∶m=1∶1)和葡萄糖和微晶纤维素粉(m∶m=1∶1)]，氮源(酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵和尿素为氮源)及无机盐(氯化铁为0.01g°L－1，氯化钙0.10 g°L－1，磷酸二氢钾 1.00 g°L－1，硫酸锰 0.30 g°L－1和氯化钠 0.10 g°L－1)进行单因素实验，分别确定目标菌株的最佳产酶条件。

1.5.2 正交实验 根据以上的各单因素实验结果，对菌株产酶的最佳碳源、氮源及无机盐进行正交实验[L9(34)]，确定目标菌株最佳培养条件。

2 结果与分析

2.1 有机覆盖物高效降解菌株筛选

经过富集培养，从常年堆积的不同腐解程度的砻糠、稻草及覆盖雷竹林土壤中初步筛选获得38株在刚果红羧甲基纤维素平板上能够产生透明水解圈的菌株，再经反复筛选出透明水解圈出现时间早，水解圈直径与菌落直径比值(HC值)较大的菌株7株(表1)，其中，真菌4株(分别编号为1.1，2.1，YQ1和YQ9)，放线菌3株(分别编号为1.2，2.2和3.1)。

表1 菌株培养3 d透明水解圈与菌落直径比值Table 1 HC values of 9 strains after 3 days cultivation

培养5 d后，从7个菌株滤纸酶活性分析表明:真菌1.1，2.1，YQ1酶活力极显著地高于放线菌、真菌YQ9及对照菌株哈茨木霉(3.93×16.67 nkat)与绿色木霉(4.64×16.67 nkat)，且以2.1菌株的滤纸酶活力最高，达10.80×16.67 nkat(图1)，确定菌株2.1为高效目标菌株。

2.2 菌株2.1生物学特性

从菌株2.1的菌落培养特征(表2)及显微结构特征(图2a)表明，菌株2.1分生孢子梗发生于基质，壁平滑，帚状枝双轮生，偶有3轮生或单轮生；梗基每轮2～3个，13.0～20.0 μm×3.2～3.7 μm，彼此通常较紧贴；瓶梗幼龄时呈现瓶状至披针状，充分成熟时近圆柱形，梗颈明显，分生孢子椭圆形，4.5～5.5 μm×3.0～4.0 μm，壁平滑。依据2.1菌落形态(图2b)及菌株显微结构特征，查《中国真菌志》(青霉及其相关有性型属)[17]、《真菌的形态和分类》[18]等相关资料可确定菌株2.1属青霉属Penicillium。

2.3 菌株2.1培养时间、起始酸碱度(pH值)和温度条件优化

图1 分离菌株的滤纸酶活力Figure 1 Filter paper activity of 9 strains

图2 菌株2.1的菌落形态(a)及显微结构(b)Figure 2 Colony morphology and microstructure of Strain 2.1

表2 菌株2.1菌落形态特征Table 2 The colony morphology of strain 2.1

2.3.1 培养时间 培养初期菌株2.1发酵液滤纸酶活力随培养时间的延长缓慢升高，第1，2天发酵液滤纸酶活力分别为2.72×16.67 nkat，3.32×16.67 nkat，增幅仅为22.51%。第3天酶活力迅速提高，4.95×16.67 nkat，较第2天增加了49.01%。第3天以后，酶活力增加趋势减缓，至第5天时发酵液酶活力达峰值(5.62×16.67 nkat)，其后酶活力虽能维持在较高水平，但较第5天有所下降(图3a)。说明菌株2.1产酶的最佳培养时间为5 d。

2.3.2 起始酸碱度(pH值) 菌株2.1发酵液滤纸酶活力随起始酸碱度(pH值)的变化呈先升高后降低的趋势(图3b)。起始酸碱度为pH 3.0～5.0时，菌株酶活力缓慢上升，且较为平稳，当起始酸碱度为pH 5.0时，发酵液滤纸酶活力达到峰值(4.90×16.67 nkat)，其后随酸碱度(pH值)的升高酶活力缓慢降低，当起始酸碱度超过pH 8.0时，酶活力开始迅速下降，至起始酸碱度为pH 10.0时，发酵液滤纸酶活力仅为2.22×16.67 nkat，为峰值的45.31%。说明菌株2.1培养的最佳起始酸碱度为pH 5.0。

2.3.3 培养温度 随着培养温度的升高，菌株2.1产酶能力呈先升高后降低的变化规律(图3c)。在25～30℃区间内酶活力急剧升高，由2.36×16.67 nkat提高到3.67×16.67 nkat，增幅达55.51%，而后酶活力趋于平稳，当温度35℃时，酶活力为3.83×16.67 nkat，其后酶活力略有降低，40℃时酶活力下降为3.68×16.67 nkat。虽然35和40℃时菌株2.1的酶活力均高于30℃的酶活力，但结合菌株培养及竹林生产实践，确定30℃为菌株2.1的最佳培养温度。

图3 培养时间(a)，起始pH值(b)和培养温度(c)对菌株2.1滤纸酶活力的影响Figure 3 Effect of time，pH and temperature on FPA of Strain 2.1

2.4 培养基组合优化

2.4.1 碳源 菌株2.1在不同碳源的培养基中均能正常生长，但在不同碳源条件下酶活力存在较大差异(图4a)。以葡萄糖、淀粉、纤维素为单一碳源时，发酵液滤纸酶活力分别为1.67×16.67 nkat，1.98×16.67 nkat和1.35×16.67 nkat。当用葡萄糖和纤维素(m∶m＝1∶1)共同作为碳源时，发酵液滤纸酶活力达到3.08×16.67 nkat，分别比葡萄糖或纤维素作单一碳源时增加了84.43%和128.15%。淀粉与纤维素(m∶m＝1∶1)共同作为碳源时，发酵液滤纸酶活力仅为0.56×16.67 nkat，远低于任一单一碳源的处理。在供试碳源中，以稻草秸秆粉做碳源时发酵液中滤纸酶活力最高(5.03×16.67 nkat)。

2.4.2 氮源 菌株2.1在多种氮源条件下均能正常生长，在有机氮源条件下发酵液滤纸酶活力均远高于无机氮源(图4b)。其中，牛肉膏为氮源时菌株发酵液滤纸酶活力最高(5.95×16.67 nkat)，其次是酵母粉(5.19×16.67 nkat)，蛋白胨为氮源时发酵液酶活(4.59×16.67 nkat)略低于牛肉膏和酵母粉为氮源的处理。以硫酸铵和尿素为氮源时酶活力较低，分别为3.13×16.67 nkat和3.18×16.67 nkat，仅为牛肉膏为氮源时的52.60%和53.44%。

图4 碳源(a)，氮源(b)和无机盐(c)对菌株2.1酶活力的影响Figure 4 Effect of C (a)，N (b) source and inorganic salt(c) on FPA of Strain 2.1

2.4.3 无机盐 菌株2.1发酵液滤纸酶活力以培养基中添加磷酸二氢钾(KH2PO4)的最高(5.40×16.67 nkat)，其次是添加氯化铁(FeCl3)的处理(5.19×16.67 nkat)。这2种无机盐处理均远高于添加氯化钙(CaCl2)，氯化钠(NaCl)和硫酸锰(MgSO4)的处理(分别为 2.98 × 16.67 nkat，2.13 × 16.67 nkat和 1.26×16.67 nkat，仅为最高酶活力的55.18%，39.44%和22.78%)(图4c)。说明磷酸二氢钾与氯化铁对菌株2.1的酶活力影响较大。

2.4.4 培养基最佳组合 从表3的菌株2.1培养基碳源(稻草秸秆)、氮源(牛肉膏)及无机盐(FeCl3)，磷酸二氢钾添加量正交实验分析表明，9号培养基配方的菌株酶活力最高(11.19×16.67 nkat)。稻草秸秆和牛肉膏对菌株酶活力影响较大，极值分别为5.69和1.00，氯化铁和磷酸二氢钾对菌株酶活力影响较小，极值分别为0.41和0.27。稻草秸秆、牛肉膏、氯化铁、磷酸二氢钾均值最大水平分别为A3，B3，C1，D2。经方差分析，各因素对菌株2.1滤纸酶活力影响均达极显著水平。表明菌株2.1产酶最适培养基组合为A3B3C1D2，即秸秆 25.00 g°L－1，牛肉膏 2.50 g°L－1，氯化铁 0.01 g°L－1，磷酸二氢钾 1.50 g°L－1。

表3 L9(34)正交实验设计及培养基组合菌株2.1酶活力Table 3 Design and results of L9(34) experiment and FPA of Strain 2.1

3 结论与讨论

本研究通过稀释涂平板法和富集培养法，从雷竹林地覆盖材料砻糠、稻草及覆盖雷竹林土壤中初步筛选得到了38个对林地有机覆盖物具有分解活性的菌株，经反复筛选得7株在刚果红羧甲基纤维素培养基上水解圈直径较大，且出现时间早的菌株(真菌4株，放线菌3株)，其中，菌株1.1，2.1，YQ1在仅有羧甲基纤维素为唯一碳源的刚果红羧甲基纤维素平板上生长旺盛，滤纸酶活力较高，而且以菌株2.1酶活力最高，远高于对照的绿色木霉和哈茨木霉。由于滤纸是聚合度和结晶度都居 “中等”的纤维性材料，滤纸酶活综合反映了纤维素酶系统中3类酶的综合效果[19]。因此，可以推断菌株2.1可能具有较全面的酶系，将其定为目标菌株。经菌落培养特征和显微结构特征观察，菌株2.1属青霉属。

随培养时间的延长，菌株2.1滤纸酶活呈先升高而后降低的趋势，培养5 d后酶活力最高。菌株2.1在起始酸碱度为pH 3.0～5.0范围内滤纸酶活较高，酸碱度超过pH 5.0后滤纸酶活力开始下降，这与普遍认为的酸性条件有利于真菌产纤维素酶的结论一致[16]。浙江省的笋用竹林土壤大多为红壤或黄红壤、黄壤，呈酸性[20]，适宜菌株2.1的产酶潜力发挥。温度对微生物生长发育有着重要影响，菌株2.1在30℃左右时产酶活力较高，而浙江省雷竹主栽区夏季最高气温40℃左右，菌株2.1适合浙江省雷竹林生境，能够应用于竹林存留有机覆盖物的生物降解。氮、碳及无机盐均为降解菌株生长的必需养分因子，菌株2.1的最佳氮源为牛肉膏，添加量为2.50 g°L－1，最佳碳源为稻草秸秆，添加量为25.00 g°L－1，对菌株产酶活性有较大影响的无机盐为氯化铁和磷酸二氢钾，添加量分别为0.01 g°L－1和1.50 g°L－1。

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