甲基化在肺癌中的意义

隋小芳，王凤玲，黄佳滨

（佳木斯大学附属第一医院 老年病科，黑龙江 佳木斯154002）

肺癌是当今世界各国最常见的恶性肿瘤之一。其发病数与死亡数成明显上升趋势 ，已成为严重威胁人民生命健康主要恶性肿瘤。肺癌的发生是一个复杂的生物学过程，有着多种因素参与其复杂的多步骤生物学变化，在其发生和发展过程中涉及基因遗传信息的改变。因此，必须从本质上阐述其病因和发病机制，从分子机理的防治水平着手，表观遗传学机制具有重要作用［1］。DNA甲基化是基因遗传信息的改变的最重要因素，是一种表观遗传修饰方式，基因异常甲基化抑制基因转录与胚胎发育和肿瘤发生发展密切相关。在肿瘤的发生发展中很多因子发生了异常的变化，他们在肿瘤的进展中扮演了很重要的角色，因此要明确肿瘤的发病机理就应当深入的研究这些重要因子异常变化的临床意义。在NSCLC发生发展中抑癌基因5′－CpG岛甲基化较频繁，并在肿瘤早期就可检测到较多的异常甲基化，因此检测该种基因异常甲基化为NSCLC早期诊断和干预治疗提供了新的靶点，展现了良好的前景。CDH13正是肺癌的一个抑癌基因，其基因发生异常甲基化，抑制了基因的转录水平，组织中CDH13表达下调，其基因甲基化和蛋白表达下调参与了肺癌的发生发展过程，是肺癌发生发展的一个重要因素。本研究中DNA甲基化的检测方法主要有三大类［2］：本实验应用了 MSP方法，本实验通过监测CDH13蛋白在组织中表达和其基因异常甲基化的观察，研究了CDH13因子与肺癌发生发展过程的相关性，是否存在甲基化及其甲基化率的临床意义，明确CDH13的表达水平与该基因甲基化的相关性，将有可能更加全面真实地揭示肺癌的进而为研究肺癌的发生、发病机制提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 ①实验组：非小细胞肺癌标本40例，取自佳木斯大学附属第一医院2009年10月－2010年10月间肺癌患者手术切除的标本。所有患者术前均未接受过放疗或化疗，病理诊断为肺癌，按组织学类型分为鳞癌13例、腺癌27例。肺癌患者年龄为20－75岁，中位年龄为65.5岁。标本取自肉眼可见肿瘤区（未坏死）。

②对照组1：癌旁正常肺组织40例，取距离同一实验组肿瘤组织边缘5cm以上的远癌正常肺组织为对照。③对照组2：良性病变肺组织15例，组织标本取自佳木斯大学第一附属医院胸外科2009年10月一2010年10月间5例肺结核球、8例支气管扩张、2例肺错构瘤患者手术切除的肺组织。

1.1.2 标本的采集及处理 肺组织标本为肺叶切除离体后30min内迅速切取的癌组织的标本，并取距离肿瘤组织边缘5cm以上的远癌正常肺组织为对照、分装、液氮速冻、－80℃低温保存。

1.1.3 主要试剂和仪器 试剂：Trizol试剂、甲基化DNA转化试剂盒、Tris碱 、Tap DNA聚合酶等实验所需试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。CDH13甲基化引物上游引物：5’TCGCGGGGTTCGTTTTTCGC－3’；下游引物：5’－GACGTTTTCATTCATACACGCG－3’；CDH13未甲基化引物上游引物：5’－TTGTGGGGTTTGTTTTTTGT－3’，下游引物：5’－AACTTTTCATTCATACACACA－3’。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。主要实验仪器：TGL－20M高速台式冷冻离心机、TGradient PCR仪、北京市六一仪器厂DYY－Ⅲ－BB稳压稳流电泳仪、超净台－80度冰箱、凝胶成像系统和配套软件、电热恒温水温箱 核酸／蛋白定量分光光度计 液氮罐等。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取标本中基因组DNA的提取取负80℃冷冻组织块，大小约为0.2cm3尽量切碎后放入1.5ml的离心管中，加入180μl的ATL缓冲液，用研磨棒仔细研磨；加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12 000rpm，离心5min，弃上清；加1%SDS 40μl，400μl STE，1蛋白酶－K 10 μl（10mg／ml）；37℃水浴6h以上或者过夜，然后加入2μl RNA酶，37℃孵育1h；加入等体积饱和酚，摇匀。12 000rpm离心5min，用吸管吸上层液体放入另一1.5ml离心管；避免吸入蛋白层；在上清液中加入酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1），混匀。12 000rpm离心5min，吸上层放入另一1.5ml离心管；向上清液加如氯仿：异戊醇（24∶1），摇匀10 min，12 000rpm离心5min，取上清入另一管；加1／12体积醋酸钠，3倍体积的冷却后的无水乙醇，轻柔摇匀；出现白色絮状物（DNA）；20℃放置25 min，12 000rpm低温离心10min，使DNA沉淀，弃去上清；加1ml 70%乙醇洗涤，12 000rpm 低温（4℃）离心10min，去上清，重复1次；自然干燥后，加无菌去离子水500μl，充分溶解用pH8.0TE溶解，紫外分光光度仪分别在260nnl和280mn测定其吸光度值。DNA的纯度以A260／A280的比值计算，所抽提的 DNA 如 OD260／0D280介于1.7、2.0之间，则保存在－20℃备用。

1.2.2 DNA甲基化修饰 按照DNA甲基化检测试剂盒的说明对标本基因组DNA模板进行修饰操作。

先配制转化缓冲液（CVB）：加800μl dd水，100μl活化剂（ACS）和100μl稳定剂（STS）制成转换缓冲液（CVR）在涡旋混合仪上剧烈混合直到CVR彻底溶解，室温孵育10min。CVB－20℃保存，1个月有效。使用前涡旋混合确保无沉淀。配制平衡缓冲液（EQB）：加30ml 96－100%乙醇到20ml缓冲液中，室温保存。配制脱硫缓冲液（DSB）：加6ml 96%－100%乙醇到缓冲液中，室温保存。以下所有离心操作条件都是室温下≥10，000g离心1min。10μl DNA样品中加入90μl的转化缓冲液（CVB），彻底混合；92℃孵育10min，然后64℃孵育2.5h；在样品中加600μl平衡缓冲液（EQB），彻底混合；使用分离柱，离心处理，丢弃滤过液；分离柱中加入200μl平衡缓冲液（EQB），离心；然后于分离柱中加入200μl脱硫缓冲液（DSB）；室温孵育15－20min，离心；离心后在 分离柱中加入200μl平衡缓冲液（EQB），再次离心，丢弃滤过液；离心，将分离柱放入1.5ml的离心管；分离柱中加入20μl of洗脱缓冲液 （TE），孵育1min，离心，－20℃储存洗脱液。洗脱DNA－20℃可稳定保存3个月。

1.2.3 CDH13基因的甲基化扩增（MSP） 应用PCR扩增仪按照下面的循环条件扩增：DNA合成和预变性1个循环：92℃10min，PCR扩增40个循环：94℃15s，50℃15s，70℃35s，终延伸1个循环72℃10min。扩增结束后，取10微升扩增产物与1微升6×loading Buffer混合后，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶染色，用天能GIS凝胶图像系统进行拍照分析。见图1。

图1

1.3 实验结果判定

实验结果判定：甲基化阳性：样品扩增出CDH13M（甲基化）相应长度（243bP），但是未扩增出CDH13U（未甲基化）相应长度的片段，则判断该样品启动子区5’CpG岛甲基化阳性。甲基化阴性：样品未扩增出CDH13M（甲基化）相应长度（243 bP），但扩增出CDH13U（未甲基化）相应长度的片段，则判断该样品启动子区5’CpG岛甲基化阴性。

1.4 统计学处理

实验数据，采用方差齐性分析、两样本t检验，数据处理均用SPSS17.0软件完成，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在40例肺癌组织中发生CDH13基因异常甲基化的共13例，阳性率为32.5%，在40例癌旁正常组织中：发生CDH13基因异常甲基化的共3例，阳性率为7.5%，在15例肺良性病变切除肺组织中：发生CDH13基因异常甲基化的共1例，阳性率为6.7%，应用χ2检验，P＜0.05在统计学上有显著性差别，见表1。

表1 癌组织、对照组1和对照组2CDH13基因异常甲基化水平

2.2 在40例肺癌组织标本中CDH13基因异常甲基化率在患者的年龄大小、性别、有无吸烟史及TNM分期上的差异，无统计学意义（P＞0.05）；CDH13基因异常甲基化率在腺癌中明显高于鳞癌中的异常甲基化率，具有统计学意义（P＜0.05），具体见表2。

表2 CDH13在癌组织中的基因异常甲基化率在患者年龄大小、性别、吸烟史、病理类型和TNM分期上的差异性

2.3 CDH13基因异常甲基化和CDH13的表达水平呈负相关性（r＝－0.520）。

2.4 CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性率在肺癌组织中显著高于癌旁组织和非肺癌良性肺切除组织，CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化导致了CDH13的表达下调。

3 讨论

肺癌在发生发展过程中存在抑癌基因的失活［3］，近年来研究发现［4，7］，在肿瘤的发生过程中，除去DNA序列的改变之外，表观遗传学在肿瘤的发生过程中也有重要的作用，因此表观遗传学的研究逐渐成为研究的方向，其中DNA甲基化作为表观遗传学的重要内容，成为近年来肿瘤分子病因学的研究热点。在细胞基因的表达调控中起着关键的作用，实验证实在肿瘤细胞广泛存在着DNA启动子区域的异常甲基化［5］。其中抑癌基因大多数为过度甲基化，引起基因遗传学的变化从而转录抑制，导致抑癌基因失活，蛋白表达受到抑制。相对于抑癌基因的过度甲基化，癌基因大部分是不全甲基化，致使其重新开放或异常表达。近来研究显示在肺癌患者中基因启动子发生甲基化现象非常普遍，部分肿瘤相关基因甲基化是肺癌诊断、分期及治疗预后特异性较强的标识物［6］。所以DNA甲基化现在已经成为表观基因组学和表观遗传学的重要研究内容。

CDH13是一个独特的钙黏蛋白细胞黏附分子，在肿瘤发生的启动和进展过程中起到重要作用。本实验40例癌组织中CDH13蛋白的表达明显低于癌旁组织和和良性病变肺组织，癌旁组织和良性病变组织的CDH13表达正常，说明在肺癌的发生发展中CDH13蛋白表达发生了下调或者缺失，也进一步提示CDH13是一种抑癌基因。

本实验采用MSP法检测CDH13基因在肺癌、癌旁组织及良性病变肺组织基因启动子区5’CpG岛甲基化情况，在40例肺癌癌组织中有13例发生了甲基化，甲基化率为32.5%，在癌旁组织和良性病变肺组织中没有发现基因的甲基化，差异有统计学意义。在13例甲基化癌组织中年龄＜60岁的有4例，年龄＞60岁的有9例，有吸烟史者8例，没有吸烟史的5例，男性8例，女性5例，腺癌12例，鳞癌1例，TNM分期Ⅰ期5例Ⅱ期8例，腺癌的甲基化发生率远远大于鳞癌的甲基化率 且有统计学意义，随着年龄的增长，长期吸烟史，肿瘤的远处转移CDH13基因甲基化率有增加的趋势。

本实验中发现在CDH13基因异常甲基化阳性的肺癌组织标本中CDH13的表达量下调明显，CDH13正常表达的癌旁组织和非肺癌良性病变切除组织不存在基因异常甲基化，提示CDH13基因甲基化率的增高和CDH13在组织中的表达下调密切相关，并且和肿瘤的发生和发展息息相关。通过相关分析得出两者呈负相关性，推测CDH13基因异常甲基化导致了CDH13表达水平下降，并且基因异常甲基化和蛋白水平的下降共同参与了肺癌的发生和发展。

本实验研究证明CDH13具有抑制肿瘤的发生、抑制肿瘤细胞的转移、减缓肿瘤的进展作用。提示CDH13基因甲基化导致肺癌组织中CDH13蛋白表达下降，促进了肺癌的发生和发展。因此CDH13基因异常甲基化可以作为肺癌的治疗的新靶点。期望CDH13能够成为肺癌治疗的新的靶点，为肺癌的治疗开辟新的领域。

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