不同环氧合酶-2抑制剂治疗大鼠脑外伤早期炎症实验观察

河北省秦皇岛市第一医院神经外科二病区（秦皇岛066000）

吴 磊 赵建华 冯 继▲

脑外伤后的炎症反应是脑组织持续性损伤的重要原因，针对早期炎症反应的及时有效处理，会降低损伤程度，改善预后。COX-2是一种花生四烯酸代谢的限速酶，其产生的前列腺素和血栓素是脑创伤后患者发生炎症级联反应的重要介质之一［1］。近期研究表明：脑外伤早期伴随炎症反应的发生，脑组织中COX-2的表达常异常增高，且这种增高状态持续越久，预后越不良［2］。有研究表明：COX-2在脑外伤早期可以大量生成，可能是导致患者损伤加剧的重要因素之一，通过抑制COX-2的产生，可以为治疗脑创伤早期炎症反应提供新途径［3］。该研究就两种COX-2抑制剂，选择性抑制剂尼美舒利和非选择性抑制剂吲哚美辛，进行平行比较试验，并就其可能存在的机制予以浅显分析。

材料与方法

1 动物与试剂 实验动物选择SD雄性大鼠96只，体重250±2g，清洁级，购于中国军事医学科学院实验动物中心。尼美舒利由广东省药物研究所提供，吲哚美辛购自Gay man公司（英国）；COX-2引物由北京赛百胜公司合成，RT-PCR试剂盒由美国Qiagen公司生产；兔抗大鼠COX-2单克隆抗体由美国Santa公司生产；检测PGE2含量的ELISA检测试剂盒由上海太阳生物技术公司生产；Western-Blot化学发光试剂盒由美国Pierce公司生产。

2 动物与分组 将96只大鼠随机分为对照组（不接受治疗）、尼美舒利治疗组和吲哚美辛治疗组，每组32只。在打击创伤后对照组的实验动物仍然不接受任何治疗；尼美舒利和吲哚美辛治疗组分别按照6 mg／kg和25 mg／kg剂量每12h进行腹腔注射给药1次。此后分别于实验第24、48、72和96小时每组动物随机处死8只，获取鼠脑组织储存备用。动物处死前对每只大鼠行神经功能缺损综合评分，评分参照Reglodi等［3］的方法，每个时间点每只大鼠评测3次，每次间隔10 min，取算术平均值。

3 脑创伤模型的建立 以3.5 ml／kg体重对实验大鼠进行腹腔麻醉后，充分暴露大鼠的颅骨，控制其以前囟后为2.0 mm、同时以中线右侧2.0 mm为中心，以磨钻在颅骨磨一直径4 mm圆形骨窗，使硬膜保持完整，在骨窗边缘进行固定打击。将液压颅脑创伤仪连接，使打击管内部保持密闭，将峰值冲击压力控制为1.5～2.0at m、平均时程控制为23 ms冲击致伤。

4 RT-PCR检测COX-2 mRNA水平 提取大鼠脑组织的总RNA，在反转录酶进行转录后运行PCR循环反应。COX-2的引物序列是，上游5’-CCG CAG TAC AGA AAG TAT CAC-3’，下游 5’-ACA GCC CTT CAC GTT ATT G-3’，产物的大小大约为402bp。反应条件控制如下：94℃条件下3 min后连续运行45个循环，每个循环控制在94℃30 s、60℃45s、72℃30s。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分析仪分析结果。

5 Wester n-Blot检测COX-2蛋白水平 提取大鼠脑组织的总蛋白，采用Bradford法来测定其蛋白量。电泳后考马斯亮蓝染色，将蛋白转到PVDF膜上，使用Wester n封闭液在37℃下进行2h封闭，在PBS漂洗后滴加1∶500稀释的COX-2单克隆抗体在4℃下过夜，于第2日加入辣根酶标记的1∶500稀释的二抗控制温度为37℃保持2h。使用化学发光试剂盒显影，通过Bio-Rad凝胶成像系统扫描光密度值，采用Quantity One软件进行分析。

6 酶联免疫吸附法检测PGE2含量 将大鼠的每块组织都放在含有1 ml含70%甲醇的离心管中。使用超声破膜机将组织彻底匀浆，在冰上放置5 min可以使蛋白充分变性。在离心后弃掉上清液，在干燥机中将其干燥彻底，目的可以充分除去甲醇。使用1 ml的EIA缓冲液来溶解标本。操作要严格按照试剂盒说明使用EI ISA法检测PGE2含量。

7 统计学处理 本组应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 RT-PCR结果 见图1。对照组的脑组织在大鼠伤后24 h COX-2 mRNA的水平明显增高，至第3天达峰值，此后稍有下降；尼美舒利和吲哚美辛治疗组与对照组同期比较，COX-2 mRNA水平明显降低（P＜0.05），尼美舒利治疗组COX-2 mRNA水平比吲哚美辛治疗组更低，二者间有显著性差异（P＜0.05）。

图1 RT-PCR实验显示COX-2 mRNA的表达

2 Wester n-Blot结果 见图2。与COX-2 mRNA表达趋势保持一致，在大鼠脑创伤后COX-2的蛋白表达水平呈现出了明显改变。尼美舒利和吲哚美辛治疗组COX-2蛋白水平明显低于对照组（P＜0.05），尼美舒利治疗组COX-2蛋白水平比吲哚美辛治疗组更低（P＜0.05）。

3 PGE2含量测定结果 见图3。尼美舒利和吲哚美辛治疗组与对照组同期比较，PGE2含量明显降低（P＜0.05），尼美舒利治疗组PGE2水平同吲哚美辛治疗组比较，二者间无显著性差异（P＞0.05）。

4 神经功能评分 见附表。与对照组同期比较，尼美舒利和吲哚美辛治疗组实验大鼠神经功能评分明显优于对照组（P＜0.05）。两治疗组间大鼠神经功能评分比较无显著性差异（P＞0.05）。

附表 两种COX-2抑制剂治疗后脑神经功能评分比较（±s，分）

附表 两种COX-2抑制剂治疗后脑神经功能评分比较（±s，分）

注：﹡与对照组比较，P＜0.05；△与尼美舒利比较，P＞0.05

对照组 34.19±2.37 18.91±1.83 17.13±1.71 16.04±1.47 15.09±1.91尼美舒利 35.27±2.46 16.32±2.03＊ 14.67±1.56＊ 12.75±1.52＊ 11.69±1.43＊吲哚美辛 36.09±2.97 17.28±2.08＊△ 16.07±2.05＊△ 12.11±1.32＊△ 10.99±1.06＊△

图2 Wester n-Blot实验显示COX-2蛋白水平的表达

图3 ELISA实验显示PGE2水平的表达

讨 论

COX-2是一种重要的炎症介质，在前列腺素的合成过程中起到了重要作用，是一种限速酶，其可将花生四烯酸有效转化为血管活性的前列腺素前体物质，使氧自由基明显增多，从而使得脂质过氧化，DNA损伤和细胞膜破坏加剧，减弱了血管内皮细胞的血管舒张反应性，造成了细胞损伤、代谢紊乱和血管机能障碍［4］。

COX-2在正常生理情况下含量极低，脑组织的COX-2主要存在于神经细胞膜［5］。COX-2本身并没有强效的致神经损伤作用，但与COX-2活性密切相关的促炎性花生四烯酸产物是导致脑损伤持续性加重的主要原因之一。COX-2的酶解产物可以在至少3个环节上加重其脑损伤：脉管系统、血脑屏障和神经元本身［6］。血管收缩因子也是一种前列腺素，血栓素A 2（TXA2）是当前我国已知的一种血管收缩因子。前列腺素和多种白三烯可以促进其血脑屏障完全开放。选择性COX-2可以作为一种抑制剂，使得尼美舒利能剂量依赖性地减少，同时还可以大幅减少脑缺血再灌注后的梗死体积，改善脑缺血后的神经缺陷，促进功能恢复，是脑缺血性损伤治疗的有效药物［7］。非选择性COX-2抑制剂吲哚美辛是非甾体抗炎药物的代表，在临床和基础研究中都被广泛应用。但到目前为止，有关尼美舒利在脑外伤早期降低炎症反应及其与非甾体抗炎药物的疗效比较，药物作用机制等均未明确。

本研究利用大鼠脑损伤模型，对选择性COX-2抑制剂尼美舒利和非选择性COX-2抑制剂吲哚美辛在降低脑外伤早期炎症反应程度方面进行比较研究。我们的结果显示，尼美舒利在降低COX-2 mRNA水平和抑制COX-2蛋白质合成方面强于吲哚美辛，但在降低PGE2水平以及改善神经功能方面二者之间无显著性差异。这一结果提示：选择性COX-2抑制剂尼美舒利通过直接对COX-2 mRNA水平和（或）蛋白质合成的抑制作用，降低PGE2水平，进而抑制炎症反应，降低损伤程度，提高神经功能评分；与此相对应，吲哚美辛降低COX-2 mRNA水平和（或）蛋白质合成方面明显低于尼美舒利，但其降低PGE2水平和改善神经功能方面与前者比较无显著性差异，提示吲哚美辛抑制脑外伤早期炎症反应可能存在其它通路。

［1］Harris RE.Cyclooxygenase-2（cox-2）and the inflammogenesis of cancer［J］.Subcell Biochem，2007，42（1）：93-126.

［2］Strauss KI，Bar be MF，Marshall RM，etal.Pr olonged cyclooxygenase-2 induction in neurons and glia following trau matic brain injury in the rat［J］.J Neurotrau ma，2000，17（8）：695-711.

［3］Reglodi D，Tamas A，Lengvari I.Examination of sensorimotor performance following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Brain Res Bull，2003，59（2）：459-466.

［4］张 坚，徐卓群，胡 强，等.选择性环氧合酶2抑制剂对人膀胱癌细胞T24增殖和凋亡的作用［J］.癌症，2007，26（4）：377-381.

［5］Terracciano S，Aquino M，Rodriquez M，etal.Chemistry and biology of anti-inflammatory marine natural products：molecules interfering with cyclooxygenase，NF-kappaB and other unidentified tar gets［J］.Curr Med Chem，2006，13（16）：1947-1969.

［6］郭建友，杨元宵，赵宝胜，等.桂皮醇对IL-1刺激脑微血管内皮细胞COX活性及PGE2释放的影响［J］.中国药学杂志，2006，41（8）：596-599.

［7］郑 刚，张 进.COX-2抑制剂对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用研究［J］.福建医药杂志，2006，28（2）：103-105.