低氧浓度改变对神经干细胞增殖分化及HIF-1α表达的影响＊

湖北医药学院人体解剖教研室（十堰442000）

冯 娜 彭兴春 贺细菊 戴冀斌△▲ 张 涛△

材料与方法

1 实验材料 与试剂DMEM／F12培养基（武汉博士德）；特优级胎牛血清 FBS（Sig ma）；B27（Gibco）；bFGF（Peprotech）；胰酶、左旋多聚赖氨酸（Sigma）。抗体：鼠抗人anti-nestin（1∶100）（Sigma），anti-神经元特异性烯醇酶NSE（Sigma），anti-GFAP的单克隆一抗及相应的荧光标记二抗（Sigma）；兔抗鼠HIF-1α（1∶100）（武汉博士德），羊抗兔FITC荧光标记二抗（武汉博士德）；DNA分子Marker（Fer mentas）；TRIzol试剂（Promega）；c DNA试剂盒（MBI）；T aq酶（Biostar）。

2 实验方法

2.1 神经干细胞的体外培养、增殖与分化 实验动物：E12～14 d昆明小鼠（SPF级），武汉大学医学院实验动物中心提供。参照徐进等［8］的方法体外培养E12～14 d胚鼠大脑皮质部分NSCs。将培养5～7 d的神经球以每平方厘米20～30个细胞球接种于置有预先经PLL包被盖玻片的24孔培养板中，加入含10%FBS的DMEM／F12（不加任何生长因子）诱导分化。每2～3 d换液1次，观察比较并记录。

2.2 实验分组及低氧模型的建立 对照组：常氧（20%O2）组；实验组：低氧10%O2组。每组又分为低氧1 d、低氧3 d和低氧5 d组，细胞低氧时间从原代培养第1天开始计算。低氧模型为一有进、出气孔的密闭容器，通入含5%CO2，3%O2和92%N2平衡的混合气体，维持饱和湿度，置于37℃常规培养箱中。

2.3 荧光免疫细胞术鉴定 对神经球进行鼠抗Nestin、鼠抗HIF-1α免疫细胞化学染色，对分化12～14d细胞进行鼠抗NSE，鼠抗GFAP免疫细胞化学染色。

2.4 RT-PCR检测HIF-1αmRNA的表达 采用TRIzol法提取总RNA，使用Pri mer 5.0软件分析设计引物，得到小鼠HIF-1α及参照β-actin的引物序列：HIF-1α的上游引物序列为5-TCCAAGCCCTCCAAGTATGA-3’，下游引物序列为5’-TGCCTTAGCAGTGGTCGTTT-3’，扩增产物长度这202bp。βactin上游引物序列为5’-ATAAACCTGGCAATTGTC-3’，下游引物序列为5’-CCTGAGTTGAAAATGGAT-3’，扩增产物长度为280bp。RT-PCR条件：按照逆转录试剂盒说明操作，反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，54℃退火60 s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃总延伸10 min；RT-PCR产物以2%琼脂糖电泳，目的基因表达强度以Rv＝V（目的基因）／V（β-actin）的比值表示。

2.5 流式细胞术测定神经元分化率 取诱导分化10～12d的细胞，加入0.2%EDTA消化10～20 min，甲醇-20℃ 固 定20 mi m，PBS 冲 洗。1%Triton-100透化25 min，离心弃上清，加入抗NSE一抗，4℃过夜，PBS漂洗后加入FITC标记二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗两次后稀释细胞，400目尼龙网过滤，制成单细胞悬液，在流式细胞仪上测定1万个细胞，记录其中荧光标记细胞数及百分比。

3 统计学处理 本组用SPSS17.0软件处理数据，实验结果以均数±标准差（±s）表示，对于不同氧浓度的指标采用方差分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 低氧与常氧条件下NSCs体外培养 增殖早期（培养1～2d时）：初期取材的NSCs光镜下呈圆形，透亮且饱满。接种初期NSCs光镜下呈单个均匀散在分布，悬浮生长，圆形，透亮；2d左右可见数个至数十个细胞的聚集体，周边界线清晰，整个聚集体折光性好，以后聚集体增大，亦悬浮生长，形成神经球（Neur osphere）。低氧增殖3d的神经球直径可达120～200μm，均明显高于常氧组，且10%O2低氧组的神经球数目明显增多（见图1）。低氧5d，3%O2组神经球表面有少量细胞脱落的现象。高倍镜下10%O2组细胞脱落情况好于3%O2组，但两组神经球总体状况均良好。分化期：神经球在诱导分化条件下数小时内贴壁，12h左右可见短小突起从神经球内伸出；2d左右有细胞沿着长突起向外迁移；分化6～7d后可见大量细胞向外迁移并分化，体积较小的神经球大部分分化为神经元或神经胶质细胞，较大的神经球内部可见有等待分化的干细胞（见图2）。分化10～12d后神经球可完全分散呈单个细胞，突起呈双极或多极状，和邻近神经球或细胞伸出的突起连接，呈网络状。与常氧对照组相比，低氧组神经球向外分化速度较快，突起较多，随低氧时间的延长，形成的网络更为密集。

2 荧光免疫细胞术鉴定结果 增殖期神经球：可见Nestin阳性细胞，Nestin蛋白主要表达于细胞质中；各低氧组中B组和C组细胞呈HIF-1α阳性，HIF-1α蛋白主要表达于胞质中，其余HIF-1α为阴性。分化10d细胞：可见NSE与GFAP阳性细胞细胞，低氧组细胞突起较多，与相邻细胞或神经球建立更为广泛的突触联系（见图3）。

3 RT-PCR结果 见图4～5。各组均出现预期mRNA扩增条带，且表达丰度均高于对照组。3%O2组HIF-1αmRNA的相对表达量分别为0.41±0.03，0.74±0.01，0.81±0.02，进行性增强，与对照组（0.23±0.02）相比具有显著性差异（P＜0.05），3d组与5d组间无显著性差异（P＞0.05）。10%O2各组HIF-1αmRNA的相对表达量分别为0.34±0.02，0.62±0.01，0.89±0.02，与对照组相比具有显著性差异（P＜0.05）。

4 流式细胞术检测NSE阳性神经元 见附表。各低氧组NSE阳性神经元增高与常氧对照组相比，有显著性差异（P＜0.05）。

图1 培置3d NSCs倒置相差显微镜 （×100）A示常氧；B示3%O2；C示10%O2

图2 分化7d NSCs倒置相差显微镜（×100）A示常氧；B示3%O2；C示10%O2

图3 免疫细胞化学染色不同抗原的表达A为nestin阳性细胞（×100）；B为HIF-1α阳性神细胞（×100）；C为NSE阳性细胞（×400）；为D GFAP阳性细胞（×400）

附表 各组NSE阳性神经元占全部细胞的比值（±s，%，n＝4）

附表 各组NSE阳性神经元占全部细胞的比值（±s，%，n＝4）

注：与对照组比较，＊P＜0.05

组 别 3%O2组 10%O2组对照组17.90±0.46 1d组 24.04±0.23＊ 21.54±0.19＊3d组 32.60±0.41＊ 30.61±0.44＊5d组 34.02±0.58 41.09±0.61＊

图4 3%O2组各HIF-1αmRNA的PCR产物凝胶电泳

图5 10%O2各组H IF-1αmRNA的PCR产物凝胶电泳

讨 论

2000年，Morrison等［1］发现了3%O2能促进胎鼠神经嵴干细胞、中脑、纹状体及皮质等部位的中枢神经系统前体细胞的增殖。Tonchev等［2］研究了成年猴全脑缺血后细胞增殖情况，他们发现全脑缺血20 min后，在海马部位增殖细胞的数量显著增多。在体研究与离体研究结果相符，张翠萍等［3］也报道了轻中度低氧能促进胎鼠中脑NSCs的体外增殖。我们的实验室研究也发现：3%O2能促进NSCs向神经元分化，同时能提高TH阳性神经元的比例［4］。HIF-1由α、β两个亚基组成，HIF-1α既是HIF-1调节亚基，又是活性亚基。大量研究表明：HIF-1已成为低氧应答时基因表达和恢复细胞内环境稳定的调节中心。低氧引起HIF-1α转录水平的增加后，作用于一系列靶基因［5］，包括：EPO、i NOS、VEGF、酪氨酸脱羧酶和糖酵解基因等，参与无氧代谢、红细胞生成、血管形成和呼吸等低氧应答反应，提高细胞对低氧的耐受能力。Turcotte等［6］研究发现，人肾癌细胞系Caki细胞在1%O2条件下培养2h HIF-1αmRNA表达即开始增加，一直到低氧72h仍能检测到 HIF-1αmRNA的高表达，其表达丰度约为常氧组的3倍。Hayashi等［7］在体外培养的滋养层细胞上也观察到了同样的结果。

本实验研究结果显示：随低氧时间的增加，低氧组神经球密度及直径均明显高于常氧组，随低氧时间的延长，球体密度增加不多，但球体细胞数增加，甚至出现了3%O2组中低氧5d组中因神经球细胞数目过多而导致折光性下降，内部细胞死亡的现象，这些结果均表明适度低氧能够促进NSCs的体外增殖。在分化期，低氧组神经球向外分化速度较快，形成了更多的纤维联系，从形态上显示低氧有利于NSCs的生长与成熟。同时，RT-PCR结果显示：NSCs在低氧条件下，低氧1d即可检测到 HIF-1αmRNA的表达，且 HIF-1αmRNA的表达随低氧时间增加而增加，10%O2组与3%O2组相比，低氧持续时间越长，10%O2组NSCs增殖量越大。本实验研究结果还显示：NSCs具有多向分化的潜能性，可分化为神经元及神经胶质细胞，而低氧条件下，实验组NSE阳性神经元的比率也明显高于对照组，10%O2组与3%O2组相比，低氧持续时间越长，10%O2组中NSE阳性神经元的比率越大。

本实验中所设置的两个低氧组为3%O2和10%O2。最早的关于低氧的研究就是从3%O2入手的，有着较多的理论依据和支持。另外我们试图找到更能促进神经干细胞表达HIF-1αmRNA的某个氧浓度或者浓度区间，于是我们借鉴了药物半衰期T1／2这个概念，选择了正常氧浓度的一半10%O2，并期望神经干细胞能在此浓度下平稳持续的表达HIF-1αmRNA，从而获得更多的神经细胞。而实验的结果也和预期的大致相同，在10%O2的低氧条件下，神经干细胞表达的HIF-1αmRNA持续且稳定。

由此可见，低氧、HIF-1α和细胞增殖之间存在着复杂的调控关系。低氧对HIF-1α的表达调控是多水平的。不同的低氧浓度对神经干细胞表达HIF-1αmRNA也有着密切的联系。

［1］Morrison SJ，Csete M，Groves AK，etal.Culture in reduced levels of oxygen pro motes clonogenic sy mpathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells［J］.Neuroscience，2000，20（19）：7370–7376.

［2］Tonchev AB，Yamashi ma T，Zhao L，etal.Proliferation of neural and neuronal progenitors after global brain ischemia in young adult macaque monkeys［J］.Mol Cell Neurosci，2003，23（2）：292-301.

［3］张翠萍，赵 彤，朱玲玲，等.低氧对胎鼠中脑NSCs的促体外增殖作用［J］.基础医学与临床，2006，26（5）：476-480.

［4］陆蔚天，戴冀斌，黄 娟.低氧条件下中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化［J］.解剖学杂志，2006，29（4）：506-508.

［5］Ingram N，Porter C D.Transcriptional tar geting of acute hypoxiain the tumour stroma is a novel and viable strategy for cancer genet herapy［J］.Gene Ther，2005，12（13）：1058-1069.

［6］Turcotte S，Desrosiers RR，Beliveau R.HIF-1αmRNA and protein upregulation involves Rho GTPase expression during hypoxia in renal cell carcinoma［J］.J Cell Sci，2003，116（Pt 11）：2247-2260.

［7］Hayashi M，Sakata M，Takeda T，etal.Hypoxia up-regulates hypoxia-inducible factor-1 alpha expression through Rho A activation in tr ophoblast cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90（3）：1712-1719.

［8］徐 进，戴冀斌，田毅浩，等.小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2003，12（4）：429-432.