分光光度法测定芜菁中总黄酮含量

梁永红 阿提合尼木 海力茜·陶尔大洪 王松芝

维药芜菁的植物学名为芜菁，来源于十字花科植物芜菁的块根，药食同源，历史悠久，疗效显著，可用支气管炎，食欲不振，消化不良的治疗。通过研究提示芜菁药材中含有皂苷，黄酮类，糖类及其苷，生物碱，内酯，挥发油，酚类，鞣质，氨基酸，蛋白质等化学成分［1］，并且研究了多糖的提取及含量测定，而其他相关性研究尚在进行当中。

本实验选用了新疆9个不同产地的芜菁药材，按照《中国药典》(2005)的相关规定进行实验并且采用荧光分析法对其总黄酮含量进行了测定［2］，旨在以评价药材的质量，并且为相关部门今后制定该药材质量标准时提供参考依据。

1 仪器与试剂

SX721分光光度计﹙上海第三分析仪器厂﹚;索氏提取器;回流提取装置。乙醇为分析纯;5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，4%氢氧化钠溶液采用分析纯试剂自配;芦丁标准品﹙100080-200707，中国药品生物制品检定所﹚。样品为新疆9个不同产地的芜菁药材

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备［3］精确称取在105℃条件下干燥至恒定质量的芦丁标准品10.0 mg，置于100 ml容量瓶中，加入75%乙醇适量，微热溶解解，放冷后再加入75%乙醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.10 g/L的芦丁对照品溶液，低温保存，备用。

2.2 供试品溶液的制备［4］精密称取芜菁粉末1.0 g(过60目筛，60℃干燥至恒重)置索氏提取器中，加30 ml石油醚加热回流30 min，弃去石油醚提取液，利用余温挥干残留石油醚，然后加入30 ml体积分数75%乙醇加热回流120 min，过滤，滤液置100 ml容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度。

2.3 测定波长的选择 精确量吸取对照品溶液和供试品溶液5 ml，分别置于25 ml容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加入10% 硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加4% 氢氧化钠溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，在波长200～700 nm范围内进行不断缩小范围的反复连续波长扫描，以确定波长。

2.4 标准曲线绘制 分别精确量吸取芦丁标准液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml置于 25 ml容量瓶中，加入 5%的亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加入10% 硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加入4% 氢氧化钠溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，进样，在确定的波长处测定吸光度值(以不加标准溶液的相应溶液为空白对照)，得到标准液浓度(C)与吸光度(A)之间的回归方程。

2.5 正交实验设计 在预实验的基础上采用索氏提取法在质量，提取工艺相同条件下，考察了乙醇浓度，料液比，提取时间等因素的影响，采用正交表L9(34)安排实验，见表1。精密称取芜菁粉末1.0 g于索氏提取器中进行正交实验，精密吸取5 ml于25 ml容量瓶中按上述“2.3”方法制成测定液，测定其吸光度值。

表1 索氏提取因素水平表

2.6 回收率试验［5］精密量取供试液1 ml，分别置于4只25 ml量瓶中，分别加入标准液 0.30，0.40，0.50，0.60 ml，再照“2.3”项的方法制成测定液，测定吸光度值，计算测定液总黄酮浓度，平均回收率及RSD值。

2.7 样品含量测定 最佳提取条件下，照“2.2”项的方法制备成供试品溶液，精确量取供试品溶液5 ml，置25 ml容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以加标准溶液的相应溶液为空白对照，在确定的波长处测定吸光度值(A)，代回归方程计算总黄酮含量。

3 结果

3.1 提取溶剂和提取方法的选择 因甲醇有毒，因此选用乙醇提取，用硝酸铝显色法，在波长510 nm处测定芜菁中总黄酮的含量。

3.2 稳定性试验 测定结果表明，提取液中加入显色剂制成测定液后稳定性逐渐变差，得稳定性试验的RSD%为1.5%，须在45 min内尽快测定为宜。提取液放置1 d后不稳定，因此应采用新鲜的提取液。

3.3 精密度、回收率试验 精密度，回收率试验的RSD值分别为0.85%(n=5)，1.6%(n=5)，平均加样回收率为101.6%，表明波长为510nm的分光光度法适用于芜菁中总黄酮的含量测定，该法操作简便，结果可靠，重现性好。

3.4 标准曲线绘制 按上述标准液制备及标准曲线的绘制方法，得到标准溶液浓度(C)和吸光度(A)间的回归方程为:A=0.01853 c+0.0097，r=0.9998，表明该方程在 0 ～0.020 mg∕ml范围内呈良好的线性关系。

图1 芦丁标准工作曲线

3.5 正交实验结果 把吸光度(A)代入标准曲线方程求出样品中总黄酮含量，结果详见表2。

3.6 最佳条件的选择 从表2和表3的数据可知，3种因素对提取结果影响大小依次为A＞B＞C。表2可知最佳提取方案为A1B3C3，但由表3可知C因素没有显著性差异，从成本考虑，最佳提取方案为A1B3C1。即最佳提取条件为用30倍原料重的75%乙醇提取120 min。在此条件下，按上述方法显色，测定其吸光度，由标准曲线计算出总黄酮质量分数为2.603%。

3.7 不同产地芜菁总黄酮含量(%)

表2 正交实验设计及结果表

表3 正交试验结果的方差分析

表4 不同产地芜菁总黄酮含量(%)

4 讨论

本实验首次采用分光光度法对新疆9个不同产地的芜菁的块根进行总黄酮含量的测定，测定结果见表4。从表中可以看出，各产地总黄酮含量均高于2.0%，故将总黄酮含量暂定为不得低于2.0%。最后确定的总黄酮最佳提取工艺是用30倍原料重的75%乙醇提取120 min。新疆不同地区芜菁中总黄酮含量有明显的不同，其中阿克苏地区的芜菁中总黄酮含量最高，其次是和静的，吐鲁番地区芜菁中总黄酮含量最低，本实验可为新疆的芜菁产品开发提供一定的理论依据。

［1］李爱华，侯宝林，泰西京，等.新疆阿克苏恰麻古多糖的提取及含量测定.新疆师范大学学报，2009，28(2):61-63.

［2］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典.北京:化学工业出版社，2005:152-153.

［3］旷南岳，海力茜.维药芜菁药材质量标准研究.西北药学杂志，2010，25(6):421-423.

［4］海力茜·陶尔大洪，巴吐尔.天山岩黄芪根中总黄酮超声提取工艺研究.时珍国医国药，2008，19(2):82-83.

［5］马合木提，海力茜.紫外分光光度法测定维药鹰嘴豆中总黄酮的含量.时珍国医国药，2007，19(4):889-890.