Chk1/2蛋白在胶质瘤和正常脑组织中的分布及意义

李勇 赖润龙 谭殿辉 陈煜 雷霆

细胞周期检测点激酶1，2(checkpoint kinase 1，2，即Chkl，Chk2)位于细胞周期检测点激活径路的终端，是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶［1］。由于目前国内外关于Chk1和Chk2在胶质细胞瘤组织中实际表达状况的报道很少，本研究采用免疫组织化学法检测Chk1、Chk2蛋白在不同胶质瘤组织和正常对照组织中的分布特点，以探讨Chk1、Chk2作为胶质瘤治疗靶点的合理性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2005年5月至2011年8月我院病理科存档处已确诊脑胶质瘤组织标本80例，其中男44例，女36例，年龄6～68岁，平均(39.7±8.4)岁。参照 WHO(2000年)胶质瘤分类及分级标准，其中髓母细胞瘤12例，室管膜瘤9例，少枝胶质细胞瘤16例，星形细胞瘤43例(其中多形性胶质母细胞瘤12例);WHOⅠ～Ⅱ级46例，WHOⅢ～Ⅳ级34例。通过内减压手术获得正常脑组织标本18例作为对照，其中男11例，女7例，年龄18～54岁，平均(32.5±6.5)岁。所有患者术前均无放疗、化疗史。组织经10% 福尔马林液固定24 h后，常规石蜡包埋、切片，先经HE染色，病理科医师光镜复查证实病理诊断后，再行免疫组化染色。

1.2 方法 所取组织常规固定、石蜡包埋、切片。采用免疫组织化学链霉亲合素-生物素-过氧化物酶法(Strept-avidin-biotin complex，SABC)染色，以磷酸盐缓冲液，Phosphate balanced solution，PBS)代替一抗作为阴性对照。参照Consantine等［2］的标准，高倍镜(400)下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。染色强度评分标准:不着色0分;黄色1分;棕黄色2分;黄褐色3分。阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数 ＜10%者0分;10% ～40%者1分;40% ～70%者2分;≥70%者3分。两种评分相乘，结果记为免疫组化评分值，以均数±标准差表示。

1.3 统计学方法 统计学处理采用SPSS for windows Ver.13.0统计软件包进行统计分析。采用t检验、方差分析和Peason's相关分析。以P＜0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

Chk1、Chk2蛋白在各类型胶质瘤和正常脑组织中均表达，阳性细胞表达定位在细胞核及细胞质，并以细胞核为主(见图1 A～F)。Chk1广泛表达于胶质瘤细胞中，棕黄色染色较强，而正常脑组织中染色普遍较弱。胶质瘤细胞与正常脑组织相比，Chk1蛋白表达水平有显著性差异(P=0.027)，Chk2蛋白表达水平经统计学分析差异无显著性意义(P=0.173)。(见表1)。在髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质细胞瘤以及星形细胞瘤中，Chk1、Chk2蛋白表达无显著性差异(P值分别为0.467、0.387)。在星形细胞瘤中，多形性胶质母细胞瘤与其他星形细胞瘤相比，Chk1、Chk2蛋白表达无显著性差异(P值分别为0.274、0.312)。在高级别的胶质瘤和低级别的胶质瘤中，Chk1、Chk2蛋白表达水平无明显差异(P值分别为0.301、0.135)。Chk1和Chk2蛋白在胶质瘤中的表达呈正相关(r=0.795，P＜0.001)(图2)。(见表1)。

图1 Chk1、Chk2蛋白在胶质瘤中的阳性表达

3 讨论

Sanchez［3］和 Matsuoka 等［4］首先阐述了人 Chk1 和 Chk2基因及其蛋白表达，并发现Chk1和Chk2普遍存在于人多种组织细胞及肿瘤细胞中，而且在药物及放射线照射引起的细胞周期阻滞反应中，Chk1和Chk2发挥着重要作用。研究发现，U87 mG神经胶质瘤［5］等多种肿瘤组织中均有其表达，并可能与某些肿瘤发生发展有一定的关系。

Chk1、Chk2是ATM/ATR(ATM相关基因)的下游效应基因，位于细胞周期检测点激活径路的终端，通过调控Cdc25(A、B、C)、Wee1、P53 等效应蛋白，激活 DNA 损伤检测点［1］。在本研究中，通过免疫组织化学观察不同胶质瘤组织中Chk1、Chk2蛋白的分布发现，Chk1和 Chk2蛋白在所有类型的胶质瘤组织和正常脑组织中均表达，阳性细胞表达定位在细胞核及细胞质，并以细胞核为主，这种分布可能与Chk1和Chk2能够识别DNA损伤、参与一系列核内磷酸化反应的功能有关。胶质瘤细胞中，Chk1蛋白表达水平明显高于与正常脑组织，而Chk2在胶质瘤和正常脑组织中的表达无明显差别。这提示，从相对意义上而言，Chk1是一种肿瘤特异性表达蛋白，Chk1可能在胶质瘤的发生发展中起着一定的作用。由于Chk1在胶质瘤中的显著高表达，因此可以作为胶质瘤治疗的靶点，而Chk2在胶质瘤发生发展中的作用有待更进一步 的研究。

表1 Chk1、Chk2蛋白在胶质瘤中的表达

图2 Chk1和Chk2蛋白在胶质瘤中表达的相关性(r=0.795，P ＜0.001)

放射治疗是胶质瘤综合治疗的重要手段之一，不同病理类型的胶质瘤其放射敏感性亦不同，一般认为由高到低依次为髓母细胞瘤、少枝胶质细胞瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤及胶质母细胞瘤［6］。本研究中，发现Chk1、Chk2蛋白的表达水平与胶质瘤病理类型无关，这提示，Chk1、Chk2蛋白的表达与胶质瘤的放射敏感性并无相关性，Chk1、Chk2蛋白表达水平不能作为胶质瘤对放疗抗拒的判定指标。在病理分级上，Chk1、Chk2蛋白的表达水平在高级别的胶质瘤和低级别的胶质瘤中无明显差异，可见Chk1、Chk2蛋白与胶质瘤的病理分级无关。这说明Chk1、Chk2蛋白不能作为判断胶质瘤预后的指标。

Chk1和Chk2是目前被认为在细胞周期检测点中起重要作用的激酶，但对Chk1和Chk2在细胞周期检测点中的作用有不同的认识。Shigeishi［7］认为Chk1和Chk2在胃癌中表达水平与P53蛋白表达水平有明显相关性，但Chk1和Chk2之间表达无相关性。Chk1的抑制剂UCN-O1处理细胞后不仅增加P53表达的细胞对TMZ的敏感性，而且阻断TMZ诱导的Chk1活化和短暂的G2/M阻滞，从而增加细胞凋亡［5］。在P53缺失的细胞中，抑制Chk1同样可增加细胞对放射线的敏感性［8］。这些提示Chk1可能参与肿瘤耐药，但同样的研究表明Chk2不能明显增加肿瘤细胞的凋亡［9］。本研究中发现，Chk1与Chk2蛋白在胶质瘤中的表达呈正相关，这说明Chk1、Chk2蛋白在DNA损伤检测点激活可能具有协同作用。

［1］Sanchez Y，Wong C，Thoma RS，et al.Conservation of the CHK1 checkpoint pathway in mammals:linkage of DNA damage to CDK regulation through Cdc25.Science，1997，277(5331):1497-1501.

［2］Constantine A，Monteagado O，Merino HJ，et al.Immunohistochemical detection of P-glycoprotein in endometrial adenocarcinoma.Am J Pathol，1991，138:799-806.

［3］Sanchez Y，Wong C，Thoma RS，et al.Conservation of the CHK1 checkpoint pathway in mammals:linkage of DNA damage to CDK regulation through Cdc25.Science，1997，277(5331):1497-1501.

［4］Matsuoka S，Huang M，Elledge SJ.Linkage of ATM to cell cycle 39 regulation by the CHK2 protein kinase.Science，1998，282(5395):1893-1897.

［5］Hirose Y，Berger MS，Pieper RO.Abrogation of the CHK1-mediated G(2)checkpoint pathway potentiates temozolomide-induced toxicity in ap53-independent manner in human glioblastoma cells.Cancer Res，2001，61(15):5843-5849.

［6］吴承远，刘玉光.临床神经外科学.北京:人民卫生出版社，2001:233-248.

［7］Shigeishi H，Yokozaki H，Oue N，et al.Increased expression of CHK2 in human gastriccarcinomas harboring p53 mutations.Int J Cancer，2002，99:58.

［8］Zenvirt S，Kravchenko-Balasha N，Levitzki A.Status of p53 in human cancer cells does not predict efficacy of CHK1 kinaseinhibitors combined with chemotherapeutic agents.Oncogene，2010，29:6149-6159.

［9］Yeh Y，Huang Y，Lin TY，et al.The cell cycle checkpoint kinase CHK2 mediatesDNA damage-induced stabilization ofTTK/hMps1.Oncogene，2009，28(10):1366-1378.