microRNA-146a基因多态性与胃癌的相关性分析

马 博 郑建忠 (新疆医科大学第六附属医院普外科，新疆 乌鲁木齐 830002)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，目前大部分的胃癌确诊病例已处于中晚期，很多治疗结果不尽如人意。胃癌常有多种miRNA的表达异常，寻找肿瘤特异性的miRNA对于胃癌的诊断和治疗有着重要的意义〔1，2〕。已有研究显示microRNA-146a(miR-146a)+60位点处存在C→G基因多态性位点(rs2910164)，该多态性位点存在于其种子序列中，因而可能调控其成熟体，即miR-146a的表达水平〔3〕。另有研究显示该位点与胃癌发生及转移有关，但miR-146a基因多态性及miR-146a表达量与胃癌关系尚无报导〔4〕。本研究探讨 pre-miR-146a rs2910164基因多态性与胃癌发生及转移的关系;同时，进一步探讨胃癌组织中miR-146a表达量的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究设计和标本获取 收集广西医科大学第一附属医院2008年10月至2012年03月手术切除胃癌标本86例，另取年龄和性别匹配的活检正常胃黏膜42例作正常对照。

1.1.2 试剂 蛋白酶K购自默克公司;RNA提取试剂Trizol购自Takara公司;反转录试剂、miR-146a实时荧光定量试剂及内参(U6)引物均购自Applied Biosystems(ABI)公司;余试剂及缓冲液等为本实验中心储存。

1.2 方法

1.2.1 基因组抽提、PCR及产物测序 使用蛋白酶K于56℃水浴消化10 mg胃癌组织后使用酚氯仿法抽提和纯化基因组DNA。因miR-146a PCR产物过短，难以分离回收，按文献方法扩增其上下游序列，其中包含了miR-146a全长〔5〕。PCR扩增引物如下：上游引物：5'-ATTTTACAGGGCTGGGACAG-3';下游引物：5'-TCTTCCAAGCTCTTCAGCAG-3'，产物长度：227 bp。将PCR产物电泳、切胶回收后送Invitrogen公司测序，测序引物为PCR扩增体系的上游引物。

1.2.2 miR-146a表达测定 使用real-time PCR方法测定miR-146a在组织中的表达：①将组织在Trizol中低温匀浆，后使用氯仿抽提总RNA;再使用ABI公司miR-146a试剂盒进行逆转录〔6〕。②使用上述miR-146a试剂盒进行real-time PCR扩增;以2-△△CT法分析数据。使用U6作为内参。

1.3 统计学方法 应用SDPSS13.0统计软件进行分析，描述正态分布数据以s表示，以频数和百分数描述计数资料，使用基于Pearson χ2检验的方法判断对照组人群是否符合Hardy-Weinberg平衡定律;计数资料比较使用Pearson χ2检验;miR-146a在各种基因型表达差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法校正，胃癌患者癌组织与其自身正常组织miR-146a表达量差异使用配对t-检验;miR-146a表达量在转移与否的胃癌患者癌组织中的差异比较采用成组t检验。

2 结果

2.1 纳入人群临床特征 两组患者年龄、性别等基线资料比较，差异无显著性，具有可比性;肝肾功能等在两组中存在显著性差异。Hardy-Weinberg平衡定律显示对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg定律(P=0.78)。见表1。

2.2 胃癌患者与正常对照miR-146a基因型分布差异 miR-146a基因型分布在胃癌组和对照组中存在差异，表现为GG及GC基因型比例高而胃癌基因型比例低;χ2检验显示该差异存在统计学意义(P=0.03)。以胃癌患者或正常对照为因变量，以年龄、性别、肝肾功能、吸烟状况及基因型为自变量进行Lo-gistic回归分析，结果显示GG及GC基因型是胃癌的危险因素之一(GG 基因型：OR=1.26，95%CI：1.06 ～1.46;P ＜0.01;GC基因型，OR=1.15，95%CI：1.03 ～1.27;P=0.02)，即携带 GG基因型使胃癌发病风险增加26%，而GC基因型携带者胃癌发病风险增加15%。

按有无转移将结肠癌患者分为两组，分别设为T1转移组(n=26)及T0无转移组(n=60)。转移组患者GG基因型比例显著高于无转移组，GC基因型比例亦略高于无转移组。χ2检验显示两组基因型分布存在统计学差异，Logistic回归分析显示携带GG基因使转移风险增加60.5%(OR=1.61，95%CI：1.00～1.76;P ＜0.042);携带GC基因型并不增加转移风险(OR=1.08，95%CI：0.88 ～1.25，P=0.58)。见表2。

为进一步探讨miR-146a基因多态性是否与其成熟体miR-146a表达量有关，使用real-time PCR方法检测并比较了对照组中不同基因型中miR-146a表达量差异。GG和GC基因型人群miR-146a表达量均低于胃癌基因型，而GG与GC基因型携带者miR-146a表达量差异无统计学意义。表明miR-146a基因多态位点中的G等位基因可能是显性基因，介导miR-146a负性调节。

表1 纳入人群临床特征(s)

表1 纳入人群临床特征(s)

项目 胃癌组(n=86)对照组(n=42)P值60.20±12.18 62.16±10.64 0.38男/女(n)40/46 23/19 1.20吸烟〔n(%)〕 25(29.1)12(28.6)0.73肝功能谷丙转氨酶(U/L)106.39±34.58 20.13±3.64 ＜0.01谷草转氨酶(U/L)99.21±60.05 15.46±4.06 ＜0.01血肌酐(μmol/L)168.20±36.22 42.68±9.43 ＜0.01基因型分布〔n(%)〕GG 20(23.3)6(14.3)0.03 GC 44(51.2)19(43.2)胃癌〔n(%)〕 14(16.3)14(33.3)年龄(岁)

表2 胃癌转移与否人群基本特征

2.3 miR-146a在胃癌患者中的表达 上述结果证明GG基因型与胃癌发病和转移有关，且G等位基因与miR-146a表达减少有关，为进一步探讨miR-146a表达量在胃癌组织中是否降低，使用real-time PCR方法检测并比较miR-146a在胃癌组织及胃癌患者正常组织的差异。结果发现，与患者自身正常胃黏膜组织比较，胃癌组织miR-146a表达量减少。且转移组患者miR-146a表达进一步减少，表明miR-146a与胃癌发生和转移有相关性。

3 讨论

早有实验报道miR-146a在甲状腺肿瘤、胰腺肿瘤及胃癌中可能发挥作用，本研究主要观察miR-146a基因多态性与胃癌发病相关;进一步研究发现miR-146a基因多态性与miR-146a表达量相关，而后者在胃癌患者表达量升高。这些研究结果提示miR-146a基因多态性及miR-146a表达量在胃癌发生发展起作用。

miR-146a多态性除与癌症发生有关外，似乎与转移关系更为密切。已经证明的miR-146a的靶基因主要有两个：表皮生长因子受体(EGFR)及白细胞介素受体相关激酶1(IRAK1)〔8〕。这两个蛋白质作用机制相对独立，但均系影响肿瘤发生和转移的重要蛋白。EGFR作为miR-146a靶基因，已被证明在胃癌组织中得到上调〔9〕，支持本研究结果。EGFR在结构及功能上与某些癌基因颇为相似，如通过EGF-EGFR-Raf-ERK信号通路促进细胞增殖;EGFR受激动时还可直接激活核转录因子-κB(NF-κB)，从而激活 NF-κB信号通路，而后者在恶性肿瘤发生及转移中已得到充分论证。同时，已有研究显示EGFR可通过ERK及p38信号通路直接调节金属基质蛋白酶9活性，而后者作为肿瘤转移的重要物质亦基本得到公认〔10，11〕。相对于EGFR，IRAK1作用机制相对简单，IRAK1是NF-κB上游蛋白，可直接激活 NF-κB，从而参与调节胃癌发生发展〔12〕。因此，结合已有研究结果及本研究结论，支持miR-146a基因多态性→miR-146a表达量→EGFR及IRAK1表达量这一途径在胃癌发生及转移中起重要作用。

本研究存在一定缺陷，如实验主要是病例对照研究，缺乏长期随访，因而实验结果可能需要前瞻性队列研究来提供更多信息。另外，本研究样本量相对较小，可能会使研究结论受到随机误差的影响。但实验揭示了miR-146a基因多态性与胃癌发生与转移的关系，同时提示miR-146a基因多态性对胃癌的影响可能是通过miR-146a基因多态性→miR-146a表达量→EGFR及IRAK1表达量这一途径实现的〔13〕。随着研究的深入和技术的进步，相信miRNA在胃癌的发生机制上将取得突破性进展，从而为胃癌的诊断、靶基因治疗和预后预测等提供新的方法和依据。

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