Combretastatins类肿瘤血管阻断剂的构效关系研究*

周 全 ，陈建伟 ，刘晓蓉

1南京中医药大学药学院，南京 210046；2南京圣和药业有限公司，南京 210038

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，目前临床上常用的抗肿瘤药物既包括传统的细胞毒药物，也有新型的靶向抗肿瘤药物。Combretum caffrum系一种非洲灌木，其根、皮一直被当地的Xhosa人用来治疗癌症[1]，从其树干中提取分离得到的顺式二苯乙烯类化合物考布他汀（Combretastatin A4）是目前已知微管蛋白抑制剂中活性最强的化合物之一[2]。1973年，美国国家癌症研究所（NCI）首次对该种植物进行了采集[3]。1979年，亚利桑那州立大学Pettit GR教授的研究小组开始与NCI共同进行Combretum caffrum中化学成分的研究。至1987年，该小组先后从中分离得到了17个Combretastatins类化合物[4]（见图1）。

图1 Combretastatins类化合物的结构式

经筛选发现，在这些化合物中，Combretastatin A-4（CA4）及 CombretastatinA-1（CA1）的体外抗肿瘤活性及微管蛋白抑制效果最佳，且显示出选择性抑制肿瘤血管增生的活性[2]，属于微管抑制型血管阻断剂（vascular disrupting agent，VDA）。 由于 CA4和CA1的水溶性低，很难制成合适的剂型用于临床，其磷酸盐前药CA4P和OXi4503及其他结构改造物应运而生。经过多年研究，目前活跃于临床的Combretastatins化合物主要有CA4P（Ⅱ期）、Oxi-4503（Ⅱ期）及 AVE-8062（Ⅲ期）。

Combretastatins类抗肿瘤化合物结构中的顺式双键易异构化成反式构型，从而导致其半衰期较短。这个问题促使人们设计和合成改善顺式构型限制的CA4衍生物，改造主要集中在两个苯环的位置和顺式双键。本课题组依据晶体结构进行药效基团构建，发现A环三个甲氧基中对位的甲氧基不是与靶点作用所必需的，依据此发现设计并合成了6个全新目标化合物，具体的名称与结构见图2、表1。

图2 CA4衍生物的结构式

表1 6个CA4衍生物的取代基团

1 材 料

1.1 受试样品、试剂

受试样品由南京圣和药业有限公司合成室合成所得。药物及配制：CP001～CP020为测试药物，阳性对照药物为CA4及顺铂；药物分别溶于DMSO（二甲基亚砜），并等比例稀释成5个浓度（0.01～100 μmol·L-1）。

苯甲醛衍生物（上海海曲化工厂），常用试剂为市售分析纯。

1.2 细胞株、培养基

K562（人粒性白血病）、MCF-7（人乳腺癌）、DU-145（人前列腺癌）、NCI-H460（人非小细胞肺癌）、HCT-116（人结肠癌细胞）均由本实验室传代并保种。

RPMl 1640培养基（含10%胎牛血清）。

1.3 仪器

YRT-3数字熔点仪；Bruker AV-300和 Bruker AV-500型核磁共振仪；Agilent LC-MSD-Trap-SL型质谱仪；ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪；HSGF254型高效薄层层析板（烟台江友硅胶开发有限公司）；柱层析硅胶（青岛海洋化工厂，200～300目）。

Napco5420-I型及Sanyomc0175型CO2培养箱（Napco 公司和 Sanyo 公司）；Adventuxe:万分之一电子天平 （Ohaus公司）；Wellscan MK3型酶标仪（Labsystems Dragon公司）；UV-260型紫外-可见分光光度仪 （Shimadza公司）；Spectra MAX fluorescence microplate reader荧光密度测定仪 （美国Gemini XS，Molecular Devices公司）。

2 方法与结果

2.1 结构鉴定

2.1.1 5-（3-羟基-4-甲氧基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（4-甲氧基苯基）咪唑（C001）白色固体，mp 131～134℃。1H-NMR（300 MHz，CDCl3） δ：3.92（s，6H，2×OCH3），4.07（s，3H，1×OCH3），4.13（s，3H，1×OCH3），6.40～6.43 （t，1H，1×Ar-H），6.71～6.81（m，7H，7×Ar-H），7.1（m，2H，2×Ar-H），7.67（s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：433.2[M+1]+，分子量：432。

2.1.2 5-（3-羟基-4-甲氧基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（4-三氟甲基苯基）咪唑（C002）淡黄色固体，mp 111～113℃。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：3.72 （s，6H，2×OCH3），3.93 （s，3H，1×OCH3），6.34～6.35（t，1H，1×Ar-H），6.74～6.88（m，5H，5×Ar-H），7.11 （d，2H，2×Ar-H），7.64 （d，2H，2×Ar-H），7.88（s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：471.2[M+H]+，分子量：470。

2.1.3 5-（4-二甲氨基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（4-三氟甲基苯基）咪唑（C003）淡黄色固体，mp 84～84.5℃。1H-NMR（300MHz，CDCl3）δ：3.67（s，6H，2×OCH3），6.62～6.64（m，2H，2×Ar-H），7.00～7.03（m，2H，2×Ar-H），7.24～7.25（m，2H，2×Ar-H），7.59～7.60（m，3H，3×Ar-H），7.67～7.68（m，2H，2×Ar-H），7.78 （s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：468.2（M+1）+，分子量：467。

2.1.4 5-（3-氟-4-甲氧基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（3，4，5-三甲氧苯基）咪唑（300 MHz，

C004）白 色 固 体 ，mp 157～158.4℃ 。1H-NMR（CDCl3） δ：3.72 （s，12H，4×OCH3），3.85 （s，3H，1×OCH3），3.89（s，3H，1×OCH3），6.33（s，2H，2×Ar-H），6.36～6.37（d，1H，1×Ar-H），6.74～6.76（d，2H，2×Ar-H），6.89～6.92 （m，2H，2×Ar-H），6.95～6.97（m，1H，Ar-H），7.76 （s，1H，imidazole-H）。ESI-MS m/z：495.2（M+1）+，分子量：494。

2.1.5 5-（3，4，5-三甲氧基苯基）-4-（3,5-二甲氧基苯基）-1-（4-三氟甲基苯基）咪唑（C005）粘稠状液体。1H-NMR（300MHz，CDCl3） δ：3.60（s，6H，2×OCH3），3.68（s，6H，2×OCH3），3.85（m，3H，1×OCH3），6.35～6.37（m，2H，2×Ar-H），6.78～6.79（d，2H，2×Ar-H），6.88（m，1H，1×Ar-H），7.28～7.30（m，2H，2×Ar-H），7.64～7.65（m，2H，2×Ar-H），7.82（s，1H，imidazole-H）。 ESI-MS m/z：515.2（M+1）+，分子量：514。

2.1.6 5-（4-二甲氨基苯基）-4-（3，5-二甲氧基苯基）-1-（3，4，5-三甲氧基苯基）咪唑（C006）淡黄色固体，mp 151～154℃。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ（ppm）：2.93（s，6H，2×N-CH3），3.64～3.70（m，12H，4×OCH3），3.87（s，3H，1×OCH3），6.31～6.33（m，2H，2×Ar-H），6.37～6.39 （m，1H，1×Ar-H），6.62～6.64（m，2H，2×Ar-H），6.82～6.84（m，2H，2×Ar-H），7.04～7.06（m，2H，2×Ar-H），7.75 （s，1H，imidazole-H）。 ESIMS m/z：490.3（M+1）+，分子量：489。

2.2 体外抗肿瘤活性的测定

参照MTT法[5]，用酶标仪于570 nm波长下测量各孔的OD值[5]。根据孙氏综合法（改进寇氏法）计算各测试药物对各细胞株的半数抑制浓度（IC50），实验结果见表2。

根据化合物的体外抑制肿瘤细胞增殖活性结果，初步的构效关系如下：化合物C001、C003、C004、C005、C006对所测的细胞菌株显示了中等或较弱的抑制活性，而化合物C002对所测的5种细胞株均表现出较好的体外抗肿瘤活性，具有较广的抗瘤谱。其体外抗肿瘤活性与对照药CA4相当，具有进一步研究价值。

表2 化合物体外抗肿瘤活性

2.3 酶抑制的活性测定

从液氮罐中取出已纯化的Tubulin（微管蛋白）置于1.5 mL离心管，放入冰盒。PMEG缓冲液配制适 量 的 含 有 5 μmol·L-1Tubulin 和 10 μmol·L-1DAPI染色液溶液，混匀，注意避光，放入冰盒中备用。将黑色96孔板放入冰盒中预冷，然后用微量移液器将含有 Tubulin（终浓度为 5 μmol·L-1）和 DAPI（终浓度为 10 μmol·L-1）的 PMEG 缓冲液加入 96 孔板后，将待测样品加入至总体积为200 μL，对照组加入相同体积的DMSO。DMSO的终浓度保持在4%（V/V）以下。微孔内溶液快速混匀，并注意避免产生气泡。将96孔板放入预热到37℃的荧光酶标仪中，每一份样品平行测定2组。激发光和发射光波分别设定在370 nm和445 nm，每隔1min测定一次，直到达到平台期。药物诱导微管蛋白装配的EC50是聚合量达到最大聚合量50%时的药物浓度。ΔF可用平台期的荧光强度减去相应时间对照组的荧光强度得到。

应用GraphpaDPrism4软件对ΔF与药物浓度作图，并根据下述公式得到半数有效浓度EC50值，计算公式:ΔF=ΔFmaxX[drug]/（EC50+[drug]）。

按这一公式计算，化合物抑制微管蛋白聚合活性结果见表3。

表3 化合物抑制微管蛋白聚合活性

通过以上药效实验，发现化合物C002体外抗肿瘤活性与CA4相当。构效关系分析表明：B环的取代对于活性影响较大，3-OH、4-OCH3和3-F、4-OCH3的化合物活性较好，改变为其他的取代基则活性丧失。

[1]尹华熙，吴 萍，徐小平，等.抗肿瘤新药CA4P及其有关物质的IR结构解析 [J].华西药学杂志，2008，23（5）：523-5.

[2]陈再新，马维勇，张椿年.天然产物Combrestastatins的研究进展[J]. 天然产物研究与开发，2008，13（1）：76-80.

[3]Pinney KG,Jelinek C,Edvardsen K,et al.The discovery and development of the Combretastatins[J].Anti A-gents Nat Prod,2005:23-46.

[4]Lin CM,Singh SB,Chu PS,et al.Interactions of tubulin with potent natural and synthetic analogs of the antimitotic agentcombretastatin:a structure-activity study[J].Mol Pharmacol,1988,34(2):200-8.

[5]楼成华，王明艳，杨 欢，等.镰形棘豆中黄酮类化合物抗肿瘤活性的体外实验研究 [J].南京中医药大学学报，2009，25（1）：46-50.