不同激素组合对尾叶桉愈伤组织分化的影响

蔡翼+李志娟+白明珍+温小芳+彭丽君+黄真池+

摘要：取８ ｄ苗龄的尾叶桉（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith）幼苗下胚轴作外植体，以ＳＰＣａ为基本培养基，添加Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ）、噻苯隆（ＴＤＺ）、６－苄基氨基嘌呤（６－ＢＡ）３类细胞分裂素与ＩＡＡ进行组合，研究细胞分裂素与生长素比值对尾叶桉愈伤组织诱导的影响。结果表明，接种５６ ｄ后，不同浓度ＰＢＵ与ＩＡＡ的组合诱导出直径大于５ ｍｍ愈伤组织块的比例高，愈伤组织块褐化率低，形成的绿色愈伤组织块的比例高。绿色愈伤组织容易分化出不定芽。说明这３类细胞分裂素中，ＰＢＵ促进愈伤组织细胞分裂和分化的能力较强，且能有效减轻褐变。

关键词：尾叶桉（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith）；愈伤组织诱导；Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ）；噻苯隆（ＴＤＺ）；６－苄基氨基嘌呤（６－ＢＡ）

中图分类号：Ｑ９４５．４５；S79文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）09－2177-04

Ｅｆｆｅｃｔｓ of Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎs on Inducing

Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith Ｃａｌｌｕｓ

ＣＡＩ Ｙｉａ，ＬＩ Ｚｈｉ－ｊｕａｎａ，ＢＡＩ Ｍｉｎｇ－ｚｈｅｎａ，ＷＥＮ Ｘｉａｏ－ｆａｎｇａ，ＰＥＮＧ Ｌｉ－ｊｕｎａ，ＨＵＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｃｈｉａ，ｂ

（ａ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｃｈｏｏｌ；ｂ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｌａｎｔ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ ５２４０４８，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ inducing Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith ｃａｌｌｕｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒing ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ ｏｆ ８－ｄａｙ－ｏｌｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｎ ＳＰＣａ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ with Ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＩＡＡ） ｗｅｒｅ Ｎ－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－［６－（２－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ）ｙｌ］ ｕｒｅａ（ＰＢＵ）， １－ｐｈｅｎｙｌ－３－（１，２，３－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ－５－ｙｌ） ｕｒｅａ（ＴＤＺ），６－ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（６－ＢＡ）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＢＵ ａｎｄ ＩＡＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃａｌｌｉ ｂｉｇｇｅｒ ｔｈａｎ ５ ｍｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｔ ｔｈｅ ５６ｔｈ ｄａｙ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｂｒｏｗｎ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ． Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｅａｓｙ ｔｏ produce ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ． ＰＢＵ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith ｃａｌｌｕｓ． ＰＢＵ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ Smith；ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； Ｎ－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－［６－（２－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ）ｙｌ］ ｕｒｅａ（ＰＢＵ）；１－ｐｈｅｎｙｌ－３－（１，２，３－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ－５－ｙｌ） ｕｒｅａ（ＴＤＺ）；６－ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ（６－ＢＡ）

桉树（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｏｂｕｓｔａ Ｓｍｉｔｈ）原产于澳大利亚，有７００多种，具有速生、丰产、轮伐期短等特点，是优良的纸浆用材，经济效益显著［１］。桉树是世界上主要产材树种之一，其人工造林已占世界人工造林的1/5，是世界上种植面积最大的阔叶树种。我国是亚洲最大的桉树种植国［２］。桉树组织培养是林木组织培养研究最早、最多的一大类。早在１９６５年，Ｓｕｓｓｅｘ通过赤桉实生苗外植体获得了其愈伤组织。此后，国内外学者先后利用桉树木质块茎、节间、下胚轴、叶、成年桉树嫩枝段等不同器官组织培养诱导完整植株成功［３］。目前，全世界已对６０种桉树进行了组织培养技术的研究，至少３０种桉树已经在离体愈伤培养中取得成功，然而植株成功再生的树种较少［４］。桉树作为含酚类和多糖丰富的木本植物，其再生系统的建立难度较大［５］。以桉树为材料再生成功的报道中，常用６－苄基氨基嘌呤（６－ＢＡ）、Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ）、噻苯隆（ＴＤＺ）等细胞分裂素［５－７］进行处理。

本试验用８ ｄ苗龄的尾叶桉幼苗下胚轴作为外植体，以ＣａＣｌ２浓度提高到６７９．３２ ｍｇ／Ｌ的改良ＳＰＣａ培养基［６］为基本培养基， 添加不同浓度ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素组合。接种５６ ｄ后，统计愈伤组织的生长和分化情况，探讨适用于尾叶桉愈伤组织诱导的激素组合，分析激素组合和ＣＴＫ／ＩＡＡ比值对愈伤组织分化的影响，旨在为尾叶桉愈伤组织诱导及芽分化提供参考。

１材料与方法

１．１材料

尾叶桉种子，购自国家林业局桉树中心。

１．２试剂

Ｎ－苯基－Ｎ－噻唑基脲（ＰＢＵ），由广东省特色植物工程中心合成并纯化；噻苯隆（ＴＤＺ），ＭＢＣＨＥＭ公司产品；吲哚乙酸（ＩＡＡ）和６－苄基氨基嘌呤（６-ＢＡ）为国药集团化学试剂有限公司产品。

１．３种子消毒

将尾叶桉种子在蒸馏水中浸泡３ ｈ后用７０％的乙醇表面消毒４５ ｓ，用无菌水漂洗４次，清除残留乙醇。再用２０％的次氯酸钠溶液消毒８ ｍｉｎ，期间轻轻摇动三角瓶以提高灭菌效果。用无菌水漂洗４次后，再用２０％的次氯酸钠溶液浸泡８ ｍｉｎ，用无菌水漂洗６次后，将种子播种到ＳＰＣａ培养基上，置于２５ ℃暗处萌发。

１．４愈伤组织的诱导

取高３～５ ｃｍ、仅含１对子叶、苗龄为８ ｄ的无菌种子幼苗，切取８ ｍｍ长的下胚轴切段为外植体，接种于以ＳＰＣａ为基本培养基，添加０．５７ μｍｏｌ／Ｌ ＩＡＡ（吲哚乙酸）与不同浓度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ组合的培养基上（设ＣＴＫ／ＩＡＡ分别为１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０，共７个浓度梯度），置于（２５±２） ℃，暗处培养２周。然后转移至１６ ｈ/d光照、５０ μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）光照度、（２５±２） ℃培养箱继续培养６周，接种５６ ｄ后统计绿色和褐色愈伤组织的数量，计算绿色愈伤组织诱导率和褐化率并拍照。每种不同浓度梯度的激素组合设３次重复，每次重复约３０个外植体。

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绿色愈伤组织诱导率＝（绿色愈伤组织块数／总外植体数）×１００％

褐化率＝（褐色愈伤组织块数／总外植体数）×１００％

２结果与分析

２．１种子消毒处理

用２０％次氯酸钠溶液消毒２次，每次８ ｍｉｎ，播种３ ｄ后种子发芽率达１００％。第八天，幼苗长为３～５ ｃｍ，生长健壮，无畸形苗。表明这种方法既能将种子彻底消毒，又不会影响种子萌发。

２．２不同激素组合对尾叶桉愈伤组织大小的影响

由表１可知，６种激素组合中，ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合诱导出直径大于５ ｍｍ尾叶桉愈伤组织的比例最高，ＰＢＵ／ＩＡＡ的比值为１．０时，直径大于５ ｍｍ的愈伤组织比例达８９％。ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ的激素组合诱导出直径大于５ ｍｍ愈伤组织的比例最低，（ＴＤＺ＋ＰＢＵ）／ＩＡＡ的比值为３．０时，直径大于５ ｍｍ愈伤组织的诱导率仅为１３％，其他比值的ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合几乎不能诱导出直径大于５ ｍｍ的愈伤组织。前期研究发现，较大的愈伤组织块细胞分裂旺盛，分化潜力较大，不易褐化死亡［６］。

２．３不同激素组合对尾叶桉愈伤组织褐变的影响

由表２可知，６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素组合培养下尾叶桉愈伤组织褐化最为严重，平均褐化率为６３．７％。６－ＢＡ／ＩＡＡ＝４．０时，尾叶桉愈伤组织褐化率高达９３％。其他激素组合中尾叶桉愈伤组织平均褐化率差别较小，介于１０．６％与２０．０％之间。比较６个激素组合的平均褐化率，ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合的平均褐化率最低， ６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素组合平均褐化率最高。ＰＢＵ和６－ＢＡ组合使用比单独使用６－ＢＡ诱导出的愈伤组织的平均褐化率明显降低。ＴＤＺ和６－ＢＡ组合使用也能有效防止褐化。但ＰＢＵ＋ＴＤＺ组合使用抑制愈伤组织褐化的效果不明显。因此，ＰＢＵ既能明显促进尾叶桉愈伤组织块的分裂和分化，又能减轻褐化。

２．４不同激素组合对尾叶桉愈伤组织分化的影响

尾叶桉外植体接种在含ＩＡＡ与不同浓度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ组合的ＳＰＣａ培养基中培养，第七天尾叶桉愈伤组织从外植体的切割面长出，愈伤组织分化率为１００％。两周后外植体两端明显膨大。５６ ｄ时，愈伤组织分化成绿色、红色、白色、黄色、褐色愈伤。

从表３中可以看出，ＰＢＵ＋ＩＡＡ激素组合培养下尾叶桉绿色愈伤组织平均诱导率最高，为３４．０％。６－ＢＡ＋ＩＡＡ组合下绿色愈伤组织平均诱导率最低，仅为１２.0％。其他几种激素组合下绿色愈伤组织平均诱导率介于２０．０％和２６．９％之间。可见，与６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ诱导胚性细胞形成和分化的能力更强。

２．５ＰＢＵ诱导出的尾叶桉绿色愈伤及绿色愈伤组织的芽分化

观察ＰＢＵ诱导出的尾叶桉绿色愈伤组织，其表面湿润，有光泽，呈浅绿色至深绿色。愈伤组织块表面有多个可见颗粒，颗粒内可见明显的芽点（图１Ａ）。芽点逐渐增大，芽尖突破愈伤表面，芽尖周围分化出叶片，成为不定芽（图１Ｂ）。前期研究发现，桉树绿色愈伤细胞代谢旺盛，酶活性高，分化潜力大［５－７］。

３讨论

桉树的组织培养常因外植体启动分裂难、形成的愈伤组织易褐变坏死、芽分化困难等原因难以成功。６－ＢＡ是人工合成的嘌呤类细胞分裂素。ＰＢＵ和ＴＤＺ是人工合成的杂环脲类细胞分裂素。它们在启动外植体的细胞分裂分化和形成胚性愈伤组织中有广泛的应用。本研究分析了ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素组合条件下，尾叶桉愈伤组织的生长、褐化和分化情况，发现与６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ能明显促进愈伤组织块的分裂和分化，减轻褐化，促进不定芽的分化。

嘌呤类细胞分裂素６－ＢＡ虽然启动尾叶桉愈伤组织分裂的能力较强，６－ＢＡ／ＩＡＡ的比值为２．０时，直径大于５ ｍｍ愈伤组织的诱导率为３８％，但愈伤组织极易褐变坏死，失去分化能力。ＴＤＺ抑制褐化的效果与ＰＢＵ相近，但诱导形成的绿色愈伤组织诱导率明显低于ＰＢＵ。

杂环脲类细胞分裂素可直接作用于细胞分裂素受体，引起下游信号网络中酶的活化［８］。另外，杂环脲类细胞分裂素也可通过阻止细胞分裂素的降解或抑制细胞分裂素氧化酶活性减慢细胞分裂素的分解，从而提高植物细胞中细胞分裂素的浓度［９］。脲类细胞分裂素具有功能多样、代谢稳定、不易被氧化酶氧化、作用浓度低、价格低廉等优点［１０］。其中ＰＢＵ在桉树的胚性愈伤组织诱导及植株再生中已显示出独特的优势［５－７］。ＰＢＵ在桉树分化和再生领域的独特优势将推动桉树的遗传转化，促进桉树遗传改良工作。但ＰＢＵ抑制愈伤组织褐变，促进愈伤组织细胞分裂分化和不定芽分化的机理还有待深入研究。

参考文献：

［１］ 谢耀坚．桉树组织培养研究进展［Ｊ］．世界林业研究，２０００，１３（６）：１４－１９．

［２］ 祁述雄．中国桉树［Ｍ］．北京：中国林业出版社，２００６．

［３］ 欧阳磊．桉树组培快繁中存在的问题与对策［Ｊ］．福建林业科技， ２００６， ３３（１）：２０４．

［４］ 欧阳乐军，曾富华．桉树分子育种研究进展［Ｊ］．分子植物育种， ２００８，６（６）：１１４６－１１５２．

［５］ 黄真池，欧阳乐军，曾富华，等．尾叶桉的不同类型愈伤组织芽分化与某些相关生理生化指标的关系［Ｊ］．植物生理学通讯，２０１０， ４６（２）：１４７．

［６］ ＨＵＡＮＧ Ｚ Ｃ， ＺＥＮＧ Ｆ Ｈ ， ＬＵ Ｘ Ｙ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ ｆｒｏｍ ｓｅｅｄｌｉｎｇ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２０１０，５４（１）：１３１－１３４．

［７］ 欧阳乐军，黄真池，沙月娥，等．新型分裂素ＰＢＵ对尾巨桉胚性愈伤组织诱导及植株再生的影响［Ｊ］．植物生理学报，２０１１，４７（８）：７８５－７９１．

［８］ ＨＥＩＮＴＺ Ｄ， ＥＲＸＬＥＢＥＮ Ａ， ＨＩＧＨ Ａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ ａｆｔｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００６，５（9）：２２８３－２２９３．

［９］ ＲＩＣＣＩ Ａ， ＢＥＲＴＯＬＥＴＴＩ Ｃ． Ｕｒｅａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｖｅ： Cｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１１（３）： ２６２－２７２．

［１０］ ＹＯＮＯＶＡ Ｐ． Chemlnform abstract：Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１０，３６（３－４）：１２４－１４７．

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绿色愈伤组织诱导率＝（绿色愈伤组织块数／总外植体数）×１００％

褐化率＝（褐色愈伤组织块数／总外植体数）×１００％

２结果与分析

２．１种子消毒处理

用２０％次氯酸钠溶液消毒２次，每次８ ｍｉｎ，播种３ ｄ后种子发芽率达１００％。第八天，幼苗长为３～５ ｃｍ，生长健壮，无畸形苗。表明这种方法既能将种子彻底消毒，又不会影响种子萌发。

２．２不同激素组合对尾叶桉愈伤组织大小的影响

由表１可知，６种激素组合中，ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合诱导出直径大于５ ｍｍ尾叶桉愈伤组织的比例最高，ＰＢＵ／ＩＡＡ的比值为１．０时，直径大于５ ｍｍ的愈伤组织比例达８９％。ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ的激素组合诱导出直径大于５ ｍｍ愈伤组织的比例最低，（ＴＤＺ＋ＰＢＵ）／ＩＡＡ的比值为３．０时，直径大于５ ｍｍ愈伤组织的诱导率仅为１３％，其他比值的ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合几乎不能诱导出直径大于５ ｍｍ的愈伤组织。前期研究发现，较大的愈伤组织块细胞分裂旺盛，分化潜力较大，不易褐化死亡［６］。

２．３不同激素组合对尾叶桉愈伤组织褐变的影响

由表２可知，６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素组合培养下尾叶桉愈伤组织褐化最为严重，平均褐化率为６３．７％。６－ＢＡ／ＩＡＡ＝４．０时，尾叶桉愈伤组织褐化率高达９３％。其他激素组合中尾叶桉愈伤组织平均褐化率差别较小，介于１０．６％与２０．０％之间。比较６个激素组合的平均褐化率，ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合的平均褐化率最低， ６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素组合平均褐化率最高。ＰＢＵ和６－ＢＡ组合使用比单独使用６－ＢＡ诱导出的愈伤组织的平均褐化率明显降低。ＴＤＺ和６－ＢＡ组合使用也能有效防止褐化。但ＰＢＵ＋ＴＤＺ组合使用抑制愈伤组织褐化的效果不明显。因此，ＰＢＵ既能明显促进尾叶桉愈伤组织块的分裂和分化，又能减轻褐化。

２．４不同激素组合对尾叶桉愈伤组织分化的影响

尾叶桉外植体接种在含ＩＡＡ与不同浓度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ组合的ＳＰＣａ培养基中培养，第七天尾叶桉愈伤组织从外植体的切割面长出，愈伤组织分化率为１００％。两周后外植体两端明显膨大。５６ ｄ时，愈伤组织分化成绿色、红色、白色、黄色、褐色愈伤。

从表３中可以看出，ＰＢＵ＋ＩＡＡ激素组合培养下尾叶桉绿色愈伤组织平均诱导率最高，为３４．０％。６－ＢＡ＋ＩＡＡ组合下绿色愈伤组织平均诱导率最低，仅为１２.0％。其他几种激素组合下绿色愈伤组织平均诱导率介于２０．０％和２６．９％之间。可见，与６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ诱导胚性细胞形成和分化的能力更强。

２．５ＰＢＵ诱导出的尾叶桉绿色愈伤及绿色愈伤组织的芽分化

观察ＰＢＵ诱导出的尾叶桉绿色愈伤组织，其表面湿润，有光泽，呈浅绿色至深绿色。愈伤组织块表面有多个可见颗粒，颗粒内可见明显的芽点（图１Ａ）。芽点逐渐增大，芽尖突破愈伤表面，芽尖周围分化出叶片，成为不定芽（图１Ｂ）。前期研究发现，桉树绿色愈伤细胞代谢旺盛，酶活性高，分化潜力大［５－７］。

３讨论

桉树的组织培养常因外植体启动分裂难、形成的愈伤组织易褐变坏死、芽分化困难等原因难以成功。６－ＢＡ是人工合成的嘌呤类细胞分裂素。ＰＢＵ和ＴＤＺ是人工合成的杂环脲类细胞分裂素。它们在启动外植体的细胞分裂分化和形成胚性愈伤组织中有广泛的应用。本研究分析了ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素组合条件下，尾叶桉愈伤组织的生长、褐化和分化情况，发现与６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ能明显促进愈伤组织块的分裂和分化，减轻褐化，促进不定芽的分化。

嘌呤类细胞分裂素６－ＢＡ虽然启动尾叶桉愈伤组织分裂的能力较强，６－ＢＡ／ＩＡＡ的比值为２．０时，直径大于５ ｍｍ愈伤组织的诱导率为３８％，但愈伤组织极易褐变坏死，失去分化能力。ＴＤＺ抑制褐化的效果与ＰＢＵ相近，但诱导形成的绿色愈伤组织诱导率明显低于ＰＢＵ。

杂环脲类细胞分裂素可直接作用于细胞分裂素受体，引起下游信号网络中酶的活化［８］。另外，杂环脲类细胞分裂素也可通过阻止细胞分裂素的降解或抑制细胞分裂素氧化酶活性减慢细胞分裂素的分解，从而提高植物细胞中细胞分裂素的浓度［９］。脲类细胞分裂素具有功能多样、代谢稳定、不易被氧化酶氧化、作用浓度低、价格低廉等优点［１０］。其中ＰＢＵ在桉树的胚性愈伤组织诱导及植株再生中已显示出独特的优势［５－７］。ＰＢＵ在桉树分化和再生领域的独特优势将推动桉树的遗传转化，促进桉树遗传改良工作。但ＰＢＵ抑制愈伤组织褐变，促进愈伤组织细胞分裂分化和不定芽分化的机理还有待深入研究。

参考文献：

［１］ 谢耀坚．桉树组织培养研究进展［Ｊ］．世界林业研究，２０００，１３（６）：１４－１９．

［２］ 祁述雄．中国桉树［Ｍ］．北京：中国林业出版社，２００６．

［３］ 欧阳磊．桉树组培快繁中存在的问题与对策［Ｊ］．福建林业科技， ２００６， ３３（１）：２０４．

［４］ 欧阳乐军，曾富华．桉树分子育种研究进展［Ｊ］．分子植物育种， ２００８，６（６）：１１４６－１１５２．

［５］ 黄真池，欧阳乐军，曾富华，等．尾叶桉的不同类型愈伤组织芽分化与某些相关生理生化指标的关系［Ｊ］．植物生理学通讯，２０１０， ４６（２）：１４７．

［６］ ＨＵＡＮＧ Ｚ Ｃ， ＺＥＮＧ Ｆ Ｈ ， ＬＵ Ｘ Ｙ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ ｆｒｏｍ ｓｅｅｄｌｉｎｇ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，２０１０，５４（１）：１３１－１３４．

［７］ 欧阳乐军，黄真池，沙月娥，等．新型分裂素ＰＢＵ对尾巨桉胚性愈伤组织诱导及植株再生的影响［Ｊ］．植物生理学报，２０１１，４７（８）：７８５－７９１．

［８］ ＨＥＩＮＴＺ Ｄ， ＥＲＸＬＥＢＥＮ Ａ， ＨＩＧＨ Ａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｓ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ ａｆｔｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００６，５（9）：２２８３－２２９３．

［９］ ＲＩＣＣＩ Ａ， ＢＥＲＴＯＬＥＴＴＩ Ｃ． Ｕｒｅａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｖｅ： Cｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１１（３）： ２６２－２７２．

［１０］ ＹＯＮＯＶＡ Ｐ． Chemlnform abstract：Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１０，３６（３－４）：１２４－１４７．

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绿色愈伤组织诱导率＝（绿色愈伤组织块数／总外植体数）×１００％

褐化率＝（褐色愈伤组织块数／总外植体数）×１００％

２结果与分析

２．１种子消毒处理

用２０％次氯酸钠溶液消毒２次，每次８ ｍｉｎ，播种３ ｄ后种子发芽率达１００％。第八天，幼苗长为３～５ ｃｍ，生长健壮，无畸形苗。表明这种方法既能将种子彻底消毒，又不会影响种子萌发。

２．２不同激素组合对尾叶桉愈伤组织大小的影响

由表１可知，６种激素组合中，ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合诱导出直径大于５ ｍｍ尾叶桉愈伤组织的比例最高，ＰＢＵ／ＩＡＡ的比值为１．０时，直径大于５ ｍｍ的愈伤组织比例达８９％。ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ的激素组合诱导出直径大于５ ｍｍ愈伤组织的比例最低，（ＴＤＺ＋ＰＢＵ）／ＩＡＡ的比值为３．０时，直径大于５ ｍｍ愈伤组织的诱导率仅为１３％，其他比值的ＴＤＺ＋ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合几乎不能诱导出直径大于５ ｍｍ的愈伤组织。前期研究发现，较大的愈伤组织块细胞分裂旺盛，分化潜力较大，不易褐化死亡［６］。

２．３不同激素组合对尾叶桉愈伤组织褐变的影响

由表２可知，６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素组合培养下尾叶桉愈伤组织褐化最为严重，平均褐化率为６３．７％。６－ＢＡ／ＩＡＡ＝４．０时，尾叶桉愈伤组织褐化率高达９３％。其他激素组合中尾叶桉愈伤组织平均褐化率差别较小，介于１０．６％与２０．０％之间。比较６个激素组合的平均褐化率，ＰＢＵ＋ＩＡＡ组合的平均褐化率最低， ６－ＢＡ＋ＩＡＡ的激素组合平均褐化率最高。ＰＢＵ和６－ＢＡ组合使用比单独使用６－ＢＡ诱导出的愈伤组织的平均褐化率明显降低。ＴＤＺ和６－ＢＡ组合使用也能有效防止褐化。但ＰＢＵ＋ＴＤＺ组合使用抑制愈伤组织褐化的效果不明显。因此，ＰＢＵ既能明显促进尾叶桉愈伤组织块的分裂和分化，又能减轻褐化。

２．４不同激素组合对尾叶桉愈伤组织分化的影响

尾叶桉外植体接种在含ＩＡＡ与不同浓度梯度的ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ、ＰＢＵ＋ＴＤＺ、ＴＤＺ＋６－ＢＡ、ＰＢＵ＋６－ＢＡ组合的ＳＰＣａ培养基中培养，第七天尾叶桉愈伤组织从外植体的切割面长出，愈伤组织分化率为１００％。两周后外植体两端明显膨大。５６ ｄ时，愈伤组织分化成绿色、红色、白色、黄色、褐色愈伤。

从表３中可以看出，ＰＢＵ＋ＩＡＡ激素组合培养下尾叶桉绿色愈伤组织平均诱导率最高，为３４．０％。６－ＢＡ＋ＩＡＡ组合下绿色愈伤组织平均诱导率最低，仅为１２.0％。其他几种激素组合下绿色愈伤组织平均诱导率介于２０．０％和２６．９％之间。可见，与６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ诱导胚性细胞形成和分化的能力更强。

２．５ＰＢＵ诱导出的尾叶桉绿色愈伤及绿色愈伤组织的芽分化

观察ＰＢＵ诱导出的尾叶桉绿色愈伤组织，其表面湿润，有光泽，呈浅绿色至深绿色。愈伤组织块表面有多个可见颗粒，颗粒内可见明显的芽点（图１Ａ）。芽点逐渐增大，芽尖突破愈伤表面，芽尖周围分化出叶片，成为不定芽（图１Ｂ）。前期研究发现，桉树绿色愈伤细胞代谢旺盛，酶活性高，分化潜力大［５－７］。

３讨论

桉树的组织培养常因外植体启动分裂难、形成的愈伤组织易褐变坏死、芽分化困难等原因难以成功。６－ＢＡ是人工合成的嘌呤类细胞分裂素。ＰＢＵ和ＴＤＺ是人工合成的杂环脲类细胞分裂素。它们在启动外植体的细胞分裂分化和形成胚性愈伤组织中有广泛的应用。本研究分析了ＰＢＵ、ＴＤＺ、６－ＢＡ和ＩＡＡ的激素组合条件下，尾叶桉愈伤组织的生长、褐化和分化情况，发现与６－ＢＡ和ＴＤＺ相比，ＰＢＵ能明显促进愈伤组织块的分裂和分化，减轻褐化，促进不定芽的分化。

嘌呤类细胞分裂素６－ＢＡ虽然启动尾叶桉愈伤组织分裂的能力较强，６－ＢＡ／ＩＡＡ的比值为２．０时，直径大于５ ｍｍ愈伤组织的诱导率为３８％，但愈伤组织极易褐变坏死，失去分化能力。ＴＤＺ抑制褐化的效果与ＰＢＵ相近，但诱导形成的绿色愈伤组织诱导率明显低于ＰＢＵ。

杂环脲类细胞分裂素可直接作用于细胞分裂素受体，引起下游信号网络中酶的活化［８］。另外，杂环脲类细胞分裂素也可通过阻止细胞分裂素的降解或抑制细胞分裂素氧化酶活性减慢细胞分裂素的分解，从而提高植物细胞中细胞分裂素的浓度［９］。脲类细胞分裂素具有功能多样、代谢稳定、不易被氧化酶氧化、作用浓度低、价格低廉等优点［１０］。其中ＰＢＵ在桉树的胚性愈伤组织诱导及植株再生中已显示出独特的优势［５－７］。ＰＢＵ在桉树分化和再生领域的独特优势将推动桉树的遗传转化，促进桉树遗传改良工作。但ＰＢＵ抑制愈伤组织褐变，促进愈伤组织细胞分裂分化和不定芽分化的机理还有待深入研究。

参考文献：

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