内生拮抗菌Bacillus subtilis QZ-7抗茄子黄萎病研究

程 磊，杨廷宪，杨 佩，孙正祥，周 燚(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

内生拮抗菌BacillussubtilisQZ-7抗茄子黄萎病研究

程 磊，杨廷宪，杨 佩，孙正祥，周 燚(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

从开花期茄子的根内分离到对茄子黄萎病菌具有强烈抑制活性的拮抗菌株BacillussubtilisQZ-7，其抑菌带宽达26.60mm。定殖试验表明，QZ-7菌株能有效定殖于茄子根内，并能在茄子根际存活并保持较高菌量。对茄子种子萌发和幼苗生长影响试验表明，该菌株可促进种子萌发，并具有明显促进茎伸长生长的作用。室内盆栽试验表明，单个菌株对茄子黄萎病的防效可达86%，且持效期较长。这些结果表明，QZ-7具有进一步研究开发的价值。

茄子黄萎病；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) ；定殖；防效

黄萎病是一种世界性的土传维管束病害，由轮枝菌属大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起，俗称半边疯、黑心病，是威胁茄子生产的重要病害之一，对茄子产量和品质造成严重影响。该病原菌可以微菌核的形式在植物衰老组织中存活数年并保持侵染能力[1]，在土壤中能存活14a或更长时间[2]。目前该病害的抗病品种缺乏[3]、化学农药防效不佳。

黄萎病这类病害一直是农业生产中的难点。现在主要采取水旱轮作方式来控制该病害的发生，但由于水资源的限制，这一措施难以大面积推广实施。因此，生物防治成为防治此类病害的重要措施，特别是植物内生菌，能高效定殖于植物体内、占据有利生态位、兼具促生和其他功能，将防治在植物土传和维管束病害方面具有很强的应用前景。

本研究旨在从生物防治角度出发，从茄子根内根部筛选能定殖于茄子体内、对黄萎病菌具有很强拮抗作用的优势内生菌株，来防治茄子黄萎病。

1 材料与方法

1.1 试验菌种与培养基

茄子黄萎病原菌：由长江大学农学院提供;PSA培养基：用于病原菌培养。

筛选培养基：分别称取新鲜茄子根100g、蔗糖5g、蛋白胨5g、酵母浸出粉2g和琼脂15g，然后将100g茄子根用适量水煮沸10min，过滤，取过滤液，将蛋白胨、蔗糖和酵母浸出粉溶解，将溶液煮沸，加入琼脂，完全溶解后定容至1000ml，调节pH 6.5～7.0，分装，121℃高压蒸汽灭菌，用于培养和筛选芽孢杆菌。

1.2 拮抗细菌的分离

在茄子开花期，选择茄子黄萎病发生严重的田块，挑选长势好的健康茄子植株(植株茎秆切面无变褐现象，周围其他植株发病严重)，取其主要根部及其相连部分茎，去皮，用自来水洗净，在超净工作台上，用75%酒精消毒5min，再用0.1%升汞消毒2mim，灭菌水漂洗3次后剪碎，25℃下，灭菌水浸泡剪碎物24h(使维管束中的内生菌充分游离出来)，于80℃恒温水浴锅中处理20min(除去非芽孢杆菌细菌)，取液体30μl涂平板，25℃恒温培养，待菌落长出，挑选芽孢杆菌及类似菌菌落，进行抑菌活性检测。

1.3 拮抗细菌的活性检测

初筛：用移液枪将茄子黄萎病原菌种子液转接到装有30ml PSA液体培养基的三角瓶(100ml)中， 25℃、150r/min摇床发酵培养48h，制得病原菌溶液；将PSA培养基熔化，待其温度降到50℃时，用移液枪吸取1ml病原菌溶液，注入到50℃PSA培养基(200ml)中，混匀，倒平板，得到含病原菌平板。将分离所得的芽孢杆菌类似菌编号，于含病原菌的培养基上划线，置25℃恒温培养箱培养48h，选择周围具有明显抑菌圈的拮抗细菌。

复筛：如前所述制备含茄子黄萎菌孢子的平板，在平板中用打孔器打直径5mm的4个孔(3个孔做处理，1个孔做对照)用少许融化培养基封住孔底。将初筛的生防菌在筛选培养基(液体)中培养48h，将发酵液4℃、12000 r/min离心20min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，吸取100μl过滤液注入待测平板孔里，以灭菌水为对照，每处理重复3次，以抑菌圈半径大小判定生防菌株的抑菌活性强弱，筛选抑菌能力强的菌株。

1.4 生防菌16S rDNA测序

利用PCR扩增生防菌的16S rDNA序列。选用E.coli16S rDNA通用上游引物: 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (E.coli16S rDNA bases 9～27) ；下游引物: 5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’(E.coli16S rDNA bases 1525～1542)。PCR产物纯化后与pMD-18T载体连接，转化E.coliDH5α，挑选阳性克隆进行序列分析。

1.5 拮抗细菌对茄子萌发、幼苗生长的影响

将拮抗细菌液体发酵24h，用发酵液浸泡茄子种子1d(对照用自来水浸泡1d)，在培养皿内放2张滤纸，加无菌水保湿，将浸泡后的种子转移到培养皿内，25℃恒温培养，观察种子萌发及生长情况。

将茄子地土壤(土壤为黑棕壤：有机质1.20%，碱解氮116.8mg/kg，速效磷10.4mg/kg，速效钾140.5mg/kg，含水量42%，pH 6.8)取回，121℃高压蒸汽灭菌，待冷却后将拮抗细菌发酵液与土壤混合，分装于换盆中，3次重复，将茄子播种于花盆内，以不加拮抗细菌的为对照，5d后记录出芽率，30d比较根系生长情况。

1.6 拮抗菌定殖试验

将茄子地土壤(土壤为黑棕壤：有机质1.20%，氮116.8mg/kg，速效磷10.4mg/kg，速效钾140.5 mg/kg，含水量42%，pH 6.8)灭菌，装于钵中(每钵装2.5kg土壤)，每钵播5粒茄子种子(三月茄)，在光照12h、28℃、湿度80%和黑暗12h、24℃条件下湿度80%条件下于培养箱中培养，待茄子苗长至2～3心叶时用拮抗菌液接种：将已做标记的QZ-7配制成1×108cfu /ml菌液，分别浇灌于茄子根部(每株浇菌液10ml)，以不接菌的为对照，每个处理5钵，共50株茄子苗。

在处理后的15、30、45、60、75d测定菌株的定殖力。取植株主要根部及近地茎杆(根茎交界处到子叶着生处之间)，去皮，分别称重，表面消毒，剪碎，于25℃下用10ml无菌水浸泡24h后，取浸泡液稀释后涂平板(含氨苄西林200μg/ml)，计算茄子维管束中菌数量。

1.7 盆栽防治试验

将茄子地土壤(土壤为黑棕壤：有机质0.9%，氮112.8mg/kg，速效磷10.2mg/kg，速效钾139.5mg/kg，含水量50%，pH 6.9)、营养土，按50∶50(质量比)比例混合，再与拮抗细菌(液体发酵24h，1×108cfu/ml，按1ml/kg混合)和黄萎病菌(50cfu/ml孢子悬浮液，按1ml/kg混合)混合，分装于花盆中，以不接黄萎病菌的为对照，每钵播种10粒种子，每处理5次重复，在光照12h、28℃、湿度80%和黑暗12h、24℃条件下湿度80%条件下于培养箱中培养，处理如下：(1) QZ-7发酵液，1×108cfu/ml； (2)对照：清水处理。在浇灌后30d、45d和60d调查发病率和病情指数。

防效=[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100%；

病情指数=[∑(病级株数×代表数值)×总株数×发病最重级的代表数值]×100。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的分离与鉴定

图1 QZ-7对茄子黄萎病菌的抑制作用

经分离纯化后共得到210株细菌菌株。采用平板划线对峙法初筛得到18株活性较强的茄子黄萎病拮抗菌株，编号QZ-1、QZ-2、QZ-3、……、QZ-18。复筛结果显示，菌株QZ-7的抑菌效果最佳，抑菌带宽达26.60mm(打孔器直径为5mm)以上，而对照几乎不表现出抑菌活性(图1)。

在此基础上，利用PCR技术对菌株QZ-7的16S rDNA序列进行扩增，与GenBank 数据库中的序列进行同源比较，发现它与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)A23菌株的16S rDNA序列(GenBank: AB526464.1)有极高的同源性，相似性高达99%，初步把该菌株命名为枯草芽孢杆菌QZ-7。

2.2 拮抗细菌对茄种子萌发、幼苗生长的影响

结果表明，经QZ-7菌株处理后的茄种子和对照的出芽率没有明显区别，均在80%左右，但在出芽和生长速度方面有明显区别。经QZ-7菌株处理后的茄种子在第3d均开始出芽，而对照未出芽；在第5d时，QZ-7菌株处理后的种子幼苗根系比对照明显伸长，最长可达44mm，下胚轴长15～20mm，而对照第5d开始出芽，根长仅5mm，上胚轴伸长不明显(图2、图3)。

图2 QZ⁃7对茄子种子发芽的影响

图3 QZ⁃7处理5d后茄子幼苗根系长度和下胚轴长度

经QZ-7处理后种于花盆中，30d其长势旺于对照，植株高度明显高于对照(图4)，植株茎直径也大于对照，但根系不及对照发达(图5)。

图4 QZ-7对茄子生长长势的影响

图5 QZ-7对茄子根系的影响

2.3拮抗菌在茄子根际的定殖情况

图6 QZ-7菌株在茄子根际的定殖情况

定殖试验表明，在经标记过的QZ-7灌根的茄子根部维管束中均分离出了带标记的拮抗细菌：处理后10d分离出了QZ-7，之后其含量呈上升趋势，在30d左右达到高峰(3.1×105 cfu/g)，之后出现下降趋势，在40d和50d其含量相当 (图6)。

2.5盆栽防治情况

盆栽防治试验结果显示：(1)从时间上看，经QZ-7处理后的茄子发病率和病情指数一直保持较低水平，而对照的发病率和病情指数都相对较高；(2)QZ-7处理后，其防效可以达到86%以上，随着茄子苗的生长，病害发生率和病情指数均保持稳定，而对照有不断加剧的趋势(表1)。

表1 QZ-7对茄子黄萎病的室内防治试验结果

3 讨论

植物内生菌是一个多样性的特殊微生物类群，受到研究者的高度关注，因为植物内生菌占据植物体内有利的生态位，具有生物防治、促进植物生长、增强宿主抗逆境、抗病虫害、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性等优点[4-6]。本研究从茄子根茎维管束内筛选得到抑菌活性较强的菌株QZ-7，在PSA平板上对茄子黄萎病的抑菌带宽度均可达26.6mm(打孔器直径5mm)以上，说明该菌株的抑菌活性很强，同时QZ-7菌株对茄子具有较强的促生作用。

QZ-7在茄子的根际定殖结果表明，该菌株能长时间有效地定殖于茄子根际，而在不同的时间段，QZ-7菌株在茄子根部的种群含量是波动的，这可能是因为植物在不同的生育期，其体内物质是变化的，导致菌群的种群结构也发生相应的变化。

盆栽试验表明，QZ-7对茄子黄萎病具有很高的防效(86%以上)，随着时间的推移，经处理过的茄子病情指数有小幅下降趋势，说明这些菌株还对作物具有一定的治疗作用。

因此，该菌株是一株能有效定殖于茄子根部，并且能长时间存活于田间土壤的细菌，在抗茄子黄萎病方面具有很好的应用潜力。

[1]Arslan M,Dervis S.Antifungal activity of essential oils against three vegetative compatibility groups ofVerticilliumdahliae[J].World J Microbiol Biotechnol，2010，26:1813-1821.

[2]Soesanto L，Termorshuizen A J.Effect of temperature on the formation of microsclerotia ofVerticilliumdahliae[J].J Phytopathol，2001,149:685-691.

[3]刘富中，连 勇，陈钰辉，等.“ 十五 ” 期间我国茄子遗传育种研究进展[J].中国蔬菜，2006，(3)：31-34.

[4]贾 栗，陈疏影，翟永功，等．近年国内外植物内生菌产生物活性物质的研究进展[J].中草药，2007，38(11)：1750-1754．

[5]Benhamou N，KioIOFPPER J W，QUADT-HAILM A,et al.Induction of defense related ultrastrurual modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria [J].Plant Physiology，1996,1123：919-929.

[6]孙力军，陆兆新，别小妹，等．1株抗菌植物内生菌EJH-2菌株的分离和鉴定[J]．中国微生物学杂志，2006，18(1)：23-26.

S476：S435.621

A

1673-1409(2012)06-S001-04

2012-06-10

湖北省教育厅重大项目 (Z20091201)；国家大学生创新性实验计划项目(091048922)。

程 磊(1987-)，男，安徽阜阳人，现从事植物保护研究。

周 燚，E-mailyiyizhzh@yahoo.com.cn。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.001