罗勒水提物对秀丽隐杆线虫脂肪沉积的影响

屈长青，徐林丽，陆 娟，姬云涛

(1.阜阳师范学院 生命科学学院，2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳 236041)

罗勒(Ocimum basilicum)是唇形科罗勒属植物，也被称为九层塔、金不换等，原生于亚洲热带区，国内多栽培于安徽和河南等地，其他各省开发利用较少［1］。现代化学研究表明，罗勒主要含有挥发油类、黄酮及其苷类、香豆素类，此外还含有三萜类和生物碱类等成份［2］。现已发现罗勒对头痛、鼻窦炎、支气管炎、袪痰、伤风感冒、气喘、打嗝、胀气、肌肉酸痛、皮肤松软等都有不同程度疗效［3］。近年来，已有关于罗勒抗血栓形成、抗肿瘤转移、抗氧化、降血脂和降血糖等作用的报道［4］，但罗勒对脂肪沉积的影响尚未见报道。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)属于线形动物门、线虫纲动物，因其结构简单、通体透明、生命周期短和易于培养，而被用作为现代发育生物学、遗传学、抗衰老及脂肪调控等方面研究的理想模式生物，线虫中的许多重大发现为人们理解复杂的细胞生命活动做出了极大的贡献［5］。近年来，也有用其进行药物筛选的报道［6］。本实验通过用罗勒水提物配制的NGM培养基培养同步化秀丽隐杆线虫，发现罗勒水提物可以减少线虫体内脂质含量，但其机制有待于进一步深入研究。

1 材料

1.1 秀丽隐杆线虫及食物

N2野生型秀丽隐杆线虫(C.elegans，the Bristol strain N2)及大肠杆菌OP50由中科院等离子体物理研究所吴李君研究员惠赠;大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型，作为线虫的食物。

1.2 药品及试剂

种子培养基、NGM培养基和各种缓冲液的配制参照文献［7］。

裂解液:每100mL水中含有5 mol/L KOH溶液10mL和10%次氯酸钠溶液10mL。

2 方法

2.1 罗勒水提物与NGM培养基的配制

称取罗勒粉末10 g于水200mL中，浸泡过夜，次日过滤，取滤液配制NGM培养基。对照组中用等量水配制NGM培养基。

2.2 大肠杆菌(E.coil)的培养与接种

将OP50单菌落接种于B.broth培养液中，37℃振荡培养过夜。吸取OP50菌液于NGM平板中央，再用灭菌的玻璃棒轻轻涂布使菌液均匀分散占整个培养皿面积的2/3左右，于37℃培养12 h。

2.3 秀丽隐杆线虫的培养及同步化

将秀丽隐杆线虫接入培养好大肠杆菌的NGM平板，于20℃培养2～3 d;用M9冲洗培养平板，转移至无菌的1mL EP管中，加入裂解液裂解虫体，获得卵溶液;剧烈振荡混匀虫体，点动离心收集卵;用M9缓冲液冲洗3次后，卵置于M9溶液中25℃条件下孵化12 h，获得同步化一龄幼虫(L1)，然后将同步化的L1幼虫转移到已培养好OP50的NGM平板中，25℃培养30 h，发育成四龄幼虫(L4)。

2.4 虫体油红O染色

参照本实验室的方法［8］，将同步化的秀丽隐杆线虫接入培养好大肠杆菌的NGM平板，培养3 d后，用M9缓冲液从培养平板中各冲洗出50条至1mL EP管中，4%多聚甲醛室温固定15～30 min后，置于－80℃冰箱中冷冻15 min，43℃水浴解冻。低速离心1 min，弃上清。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次。弃去PBS，用0.1%Triton X-100、油红O溶液浸泡30 min。用PBS冲洗3次，异丙醇分化。

2.5 虫体裂解

实验组与对照组EP管中分别加入裂解液，线虫全部裂解后在490 nm波长处测定吸光度(A)值。A值反应细胞脂质变化，从而判断脂肪细胞中脂滴含量。

3 结果

3.1 虫体染色观察

在光学显微镜下观察，用1%Triton X-100和油红O联合处理30 min的线虫体内有明显的油红O着色现象，而没有处理的则为透明的(图1)。

图1 光镜下观察秀丽隐杆线虫

3.2 罗勒水提物对线虫脂肪沉积的影响

实验组和对照组的A值(n=3)分别为(0.017±0.009)和(0.026±0.002)，实验组A 值明显降低，与对照组相比，差异显著(P＜0.01)，说明罗勒水提物可抑制线虫体内的脂肪沉积。

4 讨论

目前油红O被认为是一种优良的脂肪染色染料［9］。为取得较好的染色效果，本实验先用多聚甲醛对线虫进行固定，随后用Triton X-100和油红O共同处理线虫，获到了较好的染色效果。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性，在Triton X-100的透化作用下，油红O可以有效进入线虫体内进行着色。

本实验结果显示，线虫在罗勒水提物配制的培养基中生长，经油红O染色并裂解后，其吸光度值小于对照组，说明其脂质含量较少，提示罗勒可抑制脂肪沉积，减少线虫体内的脂质含量，但其机制有待于进一步研究。目前，本实验室正进行浓度梯度实验和分子机制研究，如果将其作用机理探究清楚，可为进一步开发利用罗勒提供理论依据。

［1］毛同艳，刘淑平，李文阁.罗勒露地栽培技术与利用［J］.种子世界，2003，10:28-29.

［2］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海:上海人民出版社，1977:1354.

［3］吴冬乾，夏月明，朱玉萍.罗勒的实用栽培技术［J］.上海蔬菜，2005(2):39.

［4］周绪霞，李卫芬.罗勒的应用与展望［J］.兽药与饲料添加剂［J］.2003，8(2):25-27.

［5］秦峰松，杨崇林.小线虫，大发现:Caenorhabditis elegans在生命科学研究中的重要贡献［J］.生命科学，2006，18(5):419-424.

［6］杨再昌，杨小生.秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)在药物筛选中的应用［J］.生命科学，2009，21(4):593-598.

［7］Stiernagle，T.Maintenance of C.elegans［M］.Oxford University Press，2006:1-11.

［8］姬云涛，王亦舒，李星辰，等.秀丽隐杆线虫体内脂滴的油红O染色观察［J］.中国生化药物杂志，2011，32(2):141-142.

［9］屈长青，李东伟，朱茂英.一种改进的培养脂肪细胞染色法［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2008，17(3):329-330.