高糖环境下豚鼠膀胱ICCs细胞形态的改变

范勇洪

(平顶山市第一人民医院泌尿外科 河南 平顶山 467000)

目前研究认为ICCs可能是膀胱慢波活动的起搏器和传导者。去除了神经和体液等干扰因素后离体膀胱平滑肌条,仍可以发生自发性兴奋和收缩[1]。因此推测:DCP发病是否与膀胱ICCs样细胞的改变有关。离体的ICCs细胞在高糖环境下变化尚未见报道。本研究通过体外培养、荧光负载的方法来观察高糖环境对ICCs细胞形态学变化,以探讨DCP功能改变的细胞生物学基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

12只健康豚鼠。激光共聚焦显微镜META 510,胶原酶V(Sigma公司),Fluo－4 AM,葡萄糖,标准胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠膀胱ICCs细胞的体外培养 脱臼处死豚鼠,无菌手术取出其膀胱,取肌层并剪成碎块,胶原酶V消化后,制成无糖DMEM细胞悬液,接种于培养皿中,37℃培养箱中静置培养24h,弃去皿中培养液,分别加入含5、10、15mmol/L葡萄糖的高糖DMEM细胞培养液,分别培养24、72h。

1.2.2 激光共聚焦显微镜观察 Fluo－4AM工作液加入培养好ICCs细胞培养皿中,入培养箱内孵育40min,除去细胞外荧光染料,室温下避光静置10min。染色好Cajal间质细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。每个样本随机选60个ICCs细胞,扫描记录成象。用META自带分析软件测量细胞长度,获得荧光背景下每个细胞长度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 ICCs细胞形态学观察

胶原酶消化后的细胞贴壁生长,倒置显微镜下可见典型的ICCs细胞,形态基本一致,以胞体为中心的向相反方向延伸的两个长突起,可有分枝(图1)。

2.2 免疫荧光染色

ICCs细胞Fluo－4AM荧光染色,共聚焦显微镜下400倍视野可见不同葡萄糖浓度、不同培养时间段的ICCs细胞,随葡萄糖浓度的增加和培养时间的延长,ICCs细胞明显出现胞体缩小的现象(图2)。

2.3 ICCs细胞形态结果

参照McClosky[2]的方法,激光共聚焦扫描记录ICCs细胞图片,用META自带分析软件测量细胞长度值,统计学分析。组间比较:24h组和72h组对比,随葡萄糖浓度增高,ICC细胞长度明显缩短(P<0.01)。组内比较:5mmol/L组细胞长度无差异(P>0.05)。10mmol/L组随培养时间延长细胞长度增长(P<0.01)。15mmol/L组随培养时间延长细胞长度缩短(P<0.01)。

图1 倒置显微镜下ICC样细胞(×40)

图2－A ICC样细胞5mol/24h(×400)

图2－B ICC样细胞15mol/72h(×400)

表1 不同浓度不同时间段细胞长度值比较[(单位μm),()]

表1 不同浓度不同时间段细胞长度值比较[(单位μm),()]

注:▲▲P<0.01同一浓度间比较;★★P<0.01同一时间间比较

分组 5m m ol 10m m ol 15m m ol 24h 84.63±21.80 (73.71±15.23)▲▲ (67.30±1386)▲▲72h 80.88±20.81 (85.80±18.29)▲▲★★ (58.65±21.49)▲▲★★

3 讨论

糖尿病造成多系统病变。DCP是其最常见症状。该病病因复杂,研究发现DCP存在逼尿肌肌细胞[3]病变、神经退化,突触和神经递质改变、多种因子、受体分布和含量异常[4]等,但仍无法合理解释DCP的发病机制。众多研究结果显示ICCs是膀胱慢波活动的起搏器和传导者,为我们研究DCP发病机制提供了新的思路。活体内高糖对豚鼠膀胱ICCs的数量、形态及其超微结构有影响我们前期已经证实,但离体的豚鼠膀胱ICCs在单因素高糖环境中的改变目前尚未见报导。

本研研究通过对离体的豚鼠ICCs细胞培养,观察高糖环境下ICCs细胞形态的变化。结果显示5mmol/L浓度环境下ICCs细胞长度无明显差异。当葡萄糖浓度升高和培养时间延长,ICCs细胞长度明显缩短,只有10mmoL/72h组细胞长度增长。数据分析显示:正常生理浓度的葡萄糖对ICCs并无影响。10mol/L组24h细胞长度明显缩短,72h又增长,可能是高糖刺激ICCs短时间抑制了ICCs的生理功能。随培养时间延长细胞功能恢复胞内超微结构如内质网扩张、线粒体肿胀、胞质内空泡形成等,致使ICCs细胞体积增大,长度增长,造成其生理功能异常改变。15mol/L组胞体明显缩短,并随培养时间延长胞体进一步变小,可能是过高浓度的糖对ICCs直接造成破坏,随培养时间延长过高浓度的糖环境持续破坏,线粒体发生肿胀、空泡样变甚至溶解,内质网扩张,粗面内质网发生脱颗粒,胞质广泛溶解等,导致ICCs细胞进一步缩小缩短致使其结构、功能异常。

本研究结果提示,高糖环境与DCP中ICCs功能改变有重要关系。高浓度长时间的影响,致使ICCs内部结构破坏,进而造成形态改变,导致其作为起搏功能及控制肌细胞运动的结构、功能异常,导致膀胱逼尿肌收缩能力异常,临床出现DCP症状。ICCs形态结构的变化可能是DCP发生的重要病理基础之一。

[1]Jiang HH,SongB,Lu GS,et al.Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in adetrusor instability model[J].BJU Int,2005,96(3):428～433.

[2]McCloskey KD.Characterization of outward currents in interstitial cells from the guinea pig bladder[J].J Urol,2005,173(1):296～301.

[3]Andersson KE,Arner A.Urinary bladder contraction and relaxation:physiology and pathophysiology[J].Physiol Rev,2004,84:935～986.

[4]Asano T, Saito Y,KawakamI M,et al.Clinical Pharmacology Study Group. Erythrocytic sorbitol contents in diabetic patients correlate with blood aldose reductase protein contents and plasma glucose level, and are normalized by the potent aldose reductase inhibitor fidarestat(SNK-860)[J].Diabetes Comp lications,2004,18(6):336～342.