早期子宫颈鳞癌中podoplanin标记的淋巴管密度及其临床意义

王杜平， 张 颖， 王庆一

(1.珠海市妇幼保健院 妇一科,广东 珠海 519000； 2.珠海市妇幼保健院 病理科,广东 珠海 519000)

早期子宫颈鳞癌中podoplanin标记的淋巴管密度及其临床意义

王杜平1， 张 颖2， 王庆一1

(1.珠海市妇幼保健院 妇一科,广东 珠海 519000； 2.珠海市妇幼保健院 病理科,广东 珠海 519000)

目的探讨早期子宫颈癌组织中肾小球上皮细胞整合膜蛋白(podoplanin)标记的淋巴管密度(LVD)及其临床意义。方法免疫组化SP法检测38例Ⅰb1期子宫颈鳞状细胞癌和10例非癌性宫颈组织中podoplanin标记的LVD，分析其与临床病理分级的关系。结果癌组织中心及边缘组织淋巴管密度与正常子宫颈组织相比均明显增加(P<0.05，P<0.05)；癌灶边缘组织淋巴管密度为12.10±2.83条/例，明显高于癌灶中心部位淋巴管密度7.71±1.12条/例(P<0.05)。有淋巴结转移者癌灶边缘组织LVD 14.67±3.72条/例，无淋巴结转移者10.77±2.65条/例，差异有统计学意义(P<0.01)；组织学分级G1、G2和G3组癌灶边缘LVD分别为8.29±1.76条/例，11.31±3.63条/例，13.24±0.79条/例。G2组LVD明显高于G1组而低于G3组(P<0.05，P<0.05)。结论早期宫颈癌组织中LVD的增加有临床意义，其与肿瘤淋巴转移，细胞分化等临床病理因素相关，宫颈癌组织中淋巴管的生成可能在其淋巴转移过程中发挥重要作用。

宫颈癌；淋巴转移；肾小球上皮细胞整合膜蛋白

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一, 其死亡率是发展中国家女性恶性肿瘤的首位。宫颈癌的发生、发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,常常涉及到肿瘤间质细胞的改变，特别是间质内微血管和微淋巴管的变化。恶性肿瘤临床进展的关键是获得转移潜能，人类大多数的恶性肿瘤具有通过淋巴转移的特性。宫颈癌主要通过直接蔓延和淋巴结转移两种方式转移，通过血行转移者较少见，肿瘤是否已经播散到区域淋巴结对患者的预后至

关重要，可直接影响治疗方案的制定。随着淋巴管内皮细胞分离技术的改进和一些特异淋巴管内皮标志物的发现，肿瘤淋巴管生成的研究有了可靠的工具。目前常用的淋巴管内皮标志物有Podoplanin, Prox1，淋巴管内皮透明质酸受体-1和血管内皮生长因子受体-3等。其中Podoplanin被认为是较理想的淋巴管内皮标志物[1].本实验采用免疫组化法检测早期子宫颈癌组织中肾小球上皮细胞整合膜蛋白(podoplanin)的表达，通过其标记的淋巴管密度的比较, 分析其与宫颈癌临床病理因素的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择珠海市妇幼保健院妇科2009年1月至2010年6月期间手术切除的宫颈癌组织38例存档蜡块为研究对象，按照国际妇产科联盟(FIGO)标准，其临床分期均为Ⅰ b1期；组织学类型均为鳞状细胞癌；组织学分级：G1 18例，G2 11例，G3 9例；无淋巴结转移者26例，有淋巴结转移者12例；患者年龄26～70岁，中位年龄42岁。另选其他因良性疾病切除子宫得到的非癌性宫颈组织10例为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 实验试剂 采用免疫组化SP法标记淋巴管，兔抗人Podoplanin多克隆抗体工作浓度为1∶50，SP 试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司。

1.2.2 实验方法 组织蜡块4 μm连续切片，分别进行苏木素-伊红染色，Podoplanin免疫组化染色，每批切片均设有阳性对照和阴性对照，阳性对照为已知阳性的大肠癌组织切片，PBS代替一抗作为阴性对照，操作步骤按产品说明书进行。

1.2.3 结果判定 参照Weidner等[2]的报道统计LVD。阳性淋巴管判定标准：有明显管腔和棕黄色内皮细胞形成的条状、隙状孤立或簇状结构。在低倍镜下寻找癌灶内部和癌灶边缘组织阳性淋巴管密集区域，高倍镜下观察并计数，淋巴管密度以5个高倍镜视野中阳性淋巴管的平均数表示。肿瘤组织内部淋巴管密度定义为肿瘤中心组织实质内LVD，肿瘤边缘淋巴管密度定义为肿瘤组织实质周围5 mm以内的LVD。正常子宫颈组织淋巴管密度定义为基底膜下2 mm以内间质内的LVD。

1.3 统计学处理数据处理采用SPSS 13.0统计软件进行。两组之间均数的比较采用t检验，多组之间均数的比较用单向方差分析。P<0.05视为有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫颈癌组织中淋巴管形态学特点及podoplanin标记的LVD比较(见表1) 正常宫颈组织中淋巴管形态规则，呈开放状态，光镜下呈棕黄色染色，管壁较薄的单层内皮细胞构成，细胞核大且向管腔内突出，与血管明显不同。子宫颈癌组织中淋巴管主要分布在肿瘤周边组织，且管腔扩大，形态不规则。癌灶中心部位淋巴管管腔小，多为闭塞状态，呈条状、孤立或簇状结构。宫颈癌灶中心LVD为7.71±1.12，癌灶边缘LVD为12.10±2.83，对照组LVD为2.01±0.26，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.05)。

表1癌灶中心组织及边缘组织podoplanin标记的淋巴管密度比较

例数(n)LVD(条/例)对照组102.01±0.26癌灶中心组织387.71±1.12*癌灶边缘组织3812.10±2.83*△

注：*与对照组相比差异有统计学意义P<0.05，△与中心组织组相比，差异有统计学意义P<0.05

2.2 子宫颈癌淋巴管密度与临床病理因素的关系(见表2) 盆腔淋巴结转移阳性组，癌灶边缘LVD为14.67±3.72，与盆腔淋巴结转移阴性组(10.77±2.65)相比明显增加(P<0.01)。组织学分级G1、G2和G3其癌灶边缘LVD分别为8.29±1.76，11.31±3.63，13.24±0.79。与G1组相比，G2组癌灶边缘LVD明显增加(P<0.05，)，而和G3组相比，其LVD明显减少，且差异有统计学意义(P<0.05)。

表2宫颈鳞癌临床病理特征与podoplanin标记的淋巴管密度的关系

nLVD组织学分级G1188.29±1.76G21111.31±3.63*G3913.24±0.79△淋巴结转移阴性2610.77±2.65阳性1214.67±3.72△△

注：G2组与G1组相比，*P<0.05，G3组与G1组相比，△P<0.05，与淋巴转移阴性组相比，△△P<0.01

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的一大特征,也是恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一，临床及病理研究发现，当实体肿瘤长到一定程度时，需要新生血管的形成，为肿瘤内部的细胞提供营养，促进肿瘤组织进一步生长，并为肿瘤的转移提供血行通道。对肿瘤微脉管系统的生成及其与肿瘤生物学行为的研究一直倍受关注。对肿瘤血管生成的研究起步较早，并且取得了很多成果。但大部分恶性肿瘤最初的转移并不是通过血管，而是通过淋巴道，淋巴管生成的分子机制近年来成为研究癌细胞淋巴转移的热点。研究表明肿瘤细胞通过淋巴管生成调控因子的表达诱导淋巴管生成，并且可促进肿瘤细胞的淋巴道转移。新生的毛细血管与毛细淋巴管在许多方面有相似之处，普通的染色技术很难将它们分辨开来。但随着一系列淋巴管内皮细胞标记物的发现,如VEGF-C、VEGF-D、 LYVE-1、Prox1和Podoplanin等，微血管和微淋巴管的鉴别得到初步解决。

Podoplanin最初发现于肾小球足突内皮表面，继而发现其存在于成骨细胞膜、骨细胞膜、肺泡Ⅱ上皮细胞膜、淋巴管内皮细胞上。其是细胞膜上的一种糖蛋白分子，一般以二聚体形式存在。Podoplanin的表达与淋巴管管径大小有关，由单层内皮构成的毛细淋巴管表达最显著，在淋巴结部位Podoplanin表达于淋巴门处小淋巴管和淋巴窦内皮，不表达于大淋巴管和高度内皮化静脉，是一种可靠的淋巴管标记物[3]。

Podoplanin已被证实在不同恶性肿瘤组织中出现高表达，并与肿瘤转移有关。Wicki[4]等研究表明Podoplanin通过诱导细胞丝状伪足形成促进细胞极化，增加细胞侵袭性，并增加肿瘤细胞和细胞外基质粘附，从而使肿瘤细胞发生侵袭，扩散，但其不引起内皮间质化，作用机制不详。Schoppmann等[5]用抗podoplanin抗体及抗CD 34抗体对45例浸润性乳腺癌标本的微淋巴管及微血管行免疫组化染色，发现微淋巴管的水平增高及淋巴管受肿瘤侵犯与腋淋巴结转移显著相关。

肿瘤细胞产生淋巴管生成因子如VEGF-C，在淋巴生成因子的调控下，肿瘤组织淋巴管内皮细胞增殖、迁移，并形成管腔,生成新的淋巴管。肿瘤组织中新生的肿瘤淋巴管与生理状态下的淋巴管结构相似，但管壁薄，缺乏紧密的细胞连接，且数量增多，因此更利于肿瘤细胞的转移扩散。本实验观察到：子宫颈癌组织中淋巴管分布是不均的，子宫颈癌组织中癌灶中心及边缘LVD与正常子宫颈组织LVD相比，均明显增多。宫颈癌组织中淋巴管主要分布在癌周组织，其形态不规则，管腔扩大。肿瘤组织内部淋巴管呈条状、孤立或簇状结构，且管腔小，多呈闭塞状态。其原因可能是由于肿瘤组织内部癌细胞分裂增生迅速，间质静水压增高，新生的淋巴管受到挤压所致。另外，肿瘤细胞侵袭生长也会对新生的淋巴管产生破坏作用[6]。肿瘤组织周围淋巴管增多、管腔扩大，为肿瘤细胞的扩散提供了更好的转移途径。本研究结果显示，盆腔淋巴结转移阳性者其癌灶中心及边缘LVD均明显高于盆腔淋巴结转移阴性者。说明在宫颈鳞癌中，微淋巴管表达增加与肿瘤细胞转移关系密切。

本研究结果还显示，癌灶边缘组织LVD与细胞分化程度有一定关系，与高分化者相比，中分化和低分化者LVD表达明显增高，其原因可能是中、低分化者与高分化者相比恶性程度高，肿瘤细胞能够分泌更多的淋巴管生长因子，从而促进肿瘤组织淋巴管生成和淋巴结转移。

综上所述，早期子宫颈癌组织中LVD表达增加与淋巴结转移、细胞分化水平等临床病理因素有关，淋巴管生成在早期子宫颈癌淋巴转移过程中扮演了重要角色，Podoplanin标记的微淋巴管密度水平高低可以作为临床评估预后的一个指标[7]。

[1] Schacht V, Dadras S S, J ohnson LA, et al. Upregulation of the lymphatic marker podoplanin , a mucin-type transmembrane glycoprotein , in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors [J ] . Am J Pathol , 2005, 166 (3) :913-921.

[2]Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage-breast carcinoma [J]. J Natl Cancer Inst, 1992,84(24):1875-1887.

[3 ]Schach, T V, Dadras, S.S, Johnson L A, et al. Up-regulation of the lymphatic marker podoplanin, a mucin-type transmembrane glycoprotein, in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors[ J ]. Am J Pathol, 2005, 166 (3): 913- 921.

[4]Wicki, A and G. Christofori The potential role of podoplanin in tumour invasion[ J ]. Br J Cancer, 2007,96(1): 1-5.

[5 ]Schoppmann S F. ,Berghoff A., Dinhof C., et al., Podoplanin-expressing cancer-associated fibroblasts are associated with poor prognosis in invasive breast cancer. [J]Breast Cancer Res Treat, 2012,17.

[6]Williams C S, Leek R D, Robson A M, et al. Absence of lymphangiogenesis and intratumoural lymph vessel s in human metastatic breast cancer [J]. J Pat hol, 2003, 200(2):195-206.

[7]Dumoff, K L, Chu, C S, Harris, E.E, et al. Low podoplanin expression in pretreatment biopsymaterial predicts poor prognosis in advanced-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix treated by primary radiation [J]. Mod Pathol, 2006, 19 (5): 708- 716

Theclinicalsignificanceoflymphaticvesselsdensitystainedbypodoplanininearlystageofcervicalcarcinoma

Wangduping1,Zhangying2,Wangqingyi1

(1. Department of Gynecology, Maternal and Child Health Hospital, Guangdong Zhuhai, 519000; 2. Department of Pathology, Maternal and Child Health Hospital, Guangdong Zhuhai, 519000 )

ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of lymphatic vessels density (LVD) stained by podoplanin in early stage of cervical carcinoma.MethodsImmunohistochemical staining by podoplanin was used to detect LVD in 38 cases of early stage of carcinoma of uterine cervix and 12 cases of normal uterine cervix, and the correlation between LVD and tumor clinicopathological features was analyzed.ResultsThe peritumoral LVD(PLVD)and the intratumoral LVD(ILVD)were significantly higher than that of normal uterine cervix (P<0.05). The peritumoral LVD was 12.10 ± 2.83，which was much more than that in the intratumoral carcinoma (7.71 ± 1.12) (P<0.05). The PLVD with lymphatic metastasis was14.67 ±3.72, which was more than that without lymphatic metastasis (10.77±2.65) (P<0.01). The PLVD of histological grade G1, G2 and G3 were 8.29±1.76, 11.31±3.63 and 13.24±0.79, respectively. The PLVD of G2 was more than that of G1 but lower than that of G3 (P<0.05).ConclusionThe increase of LVD in early stage carcinoma of uterine cervix had clinical significance. It was relevant with the clinicopathological factors, such as lymphatic metastasis and cell differentiation. The generation of lymphatic vessels may play an important role in the lymphatic metastasis of cervical carcinoma.

Cervical carcinoma; lymphatic metastasis; podoplanin

R737

A

1000-2715(2012)01-0039-04

珠海市科技局基金资助项目 (NO:珠科2009～42)。

王庆一，男，主任医师，研究方向：妇科肿瘤。E-mail:tiger62wang@163.com。

[收稿2011-11-12；修回2011-11-22]

(编辑：谭秀荣)