正交设计优选陈皮超临界CO2萃取工艺

罗 欢，夏伦祝，韩燕全，左 冬，陈 杨

（1.安徽中医学院，安徽合肥 230038；2.安徽中医学院第一附属医院国家中医药管理局中药制剂（三级）实验室，安徽合肥 230031）

陈皮为芸香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有健脾理气、燥湿化痰的功效，为临床常用中药。研究表明陈皮脂溶性成分中含有的多甲氧基黄酮类成分对乳腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌等多种癌细胞株具有较强的抑制作用［1］，其中以川陈皮素和橘皮素药理活性较强且含量较高，由于他们较显著的抗肿瘤作用而受到日益广泛的关注［2］。目前关于陈皮提取研究的文献并不多，尤其是对提取物化学成分等基础研究更少，本实验采用超高效液相色谱法（UPLC）对陈皮超临界CO2萃取物中川陈皮素和橘皮素的含量进行测定，采用L9（34）正交试验探求陈皮的最佳超临界CO2萃取工艺，为陈皮超临界CO2萃取物的开发利用与质量控制提供了参考。

1 实验材料

1.1 实验仪器

HL-5L/50MPa-CWQⅡ型超临界CO2流体萃取设备（杭州市华黎泵业有限公司）；超高效液相色谱仪（Waters 公司Acquity UPLC 系统，包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower2 数据处理工作站）；AG285 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ3200DB 型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

含量测定用对照品批号分别为：川陈皮素（20101225）、橘皮素（20110515）由鼎瑞化工（上海）有限公司生产，经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR 和UV等光谱鉴定其结构，按本方法色谱条件，归一化法测得它们的纯度分别为98.30%、98.11%。陈皮药材饮片由安徽中医学院第一附属医院中药房提供，经鉴定为芸香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）的干燥成熟果皮；CO2气体（南京市气体化工有限公司生产，纯度≥99.5%）；甲醇（色谱纯，美国Tedia 公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 川陈皮素和橘皮素的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-水（45∶55）等度洗脱；流速：0.25 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μL；检测波长：330 nm；洗脱程序：45%乙腈等度洗脱。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品川陈皮素、橘皮素适量，配成浓度分别为川陈皮素0.612 mg/mL、橘皮素0.436 mg/mL 的对照品储备液。分别精密移取川陈皮素、橘皮素对照品储备液1 mL 于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至10 mL，临用前用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 准确称取干燥的陈皮粉末9 份，每份300 g。精密称取陈皮超临界萃取物样品（9 批）各50 mg 左右。定容至10 mL，超声，离心，取上清液，临用前用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.4 线性关系的考察 自动进样对照品溶液1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，进样量（μL）为横坐标进行线性回归，得川陈皮素回归方程为Y=832 629X-86 447（r=0.999 7），橘皮素回归方程为Y=574 293X-38 872（r=0.999 9），表明川陈皮素和橘皮素分别在0.061 2 μg～0.367 2 μg，0.043 6 μg～0.261 6 μg 范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取上述川陈皮素和橘皮素混合对照品溶液（浓度分别为0.061 2、0.043 6 mg/mL）自动重复进样6 次，测定峰面积。川陈皮素、橘皮素峰面积的RSD（n=6）分别为0.46%和0.48%，结果表明，仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称取同一批样品（表3 正交试验第三组），共6 份，按“2.1.3 项供试品溶液的制备”项下方法操作，在上述色谱条件下进样，测定峰面积，川陈皮素和橘皮素峰面积的RSD（n=6）分别为0.11%、0.04%。结果表明重复性良好。川陈皮素和橘皮素的OPLC 色谱图见图1。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0 h，1 h，2 h，3 h，4 h，8 h 进样分析，测得川陈皮素、橘皮素峰面积的RSD（n=6）分别为0.54%、0.82%。结果表明供试品溶液在8 h 内稳定性良好。

图1 UPLC 色谱图

2.1.8 加样回收率试验 取已知川陈皮素含量为15.247 mg/g，橘皮素含量为12.138 mg/g 的超临界萃取物约0.02 g，精密加入一定量的川陈皮素、橘皮素对照品溶液，按“2.1.3 项供试品溶液的制备”项下方法操作，在“2.1.1 项色谱条件”项下进样，川陈皮素平均回收率为100.06%，RSD 为3.79%；橘皮素平均回收率为98.07%，RSD 为2.57%。结果见表1。

2.2 正交试验

2.2.1 正交实验设计 对影响超临界萃取的主要因素：萃取时间（A）、萃取温度（B）、萃取压力（C）、CO2流量（D）进行L9（34）正交试验，以萃取物得率和川陈皮素、橘皮素总含量为考察指标，优选最佳超临界萃取工艺因素水平见表2，正交试验结果见表3，超临界萃取率及两种成分总含量测定结果方差分析见表4，表5。由表4 可见，萃取时间、萃取温度、CO2流速对超临界萃取率有显著影响，萃取压力对萃取率无显著影响。由表5 可见，4 个因素对萃取物中两种成分的总含量均无显著影响。综合上述各种因素，确定超临界CO2萃取陈皮的最佳萃取工艺条件为A2B2C1D2，即萃取时间2 h，温度35 ℃，压力30 MPa，流速20 Kg/h。

2.2.2 最佳萃取工艺条件的验证 准确称取陈皮粉末3 份，每份300 g，按最佳萃取工艺条件平行操作，按“2.1.3 项供试品溶液的制备”项下方法制备成样品溶液，自动进样测定，并计算样品含量。结果表明，用最佳工艺条件萃取陈皮的萃取率为1.96%（RSD=0.32%，n=3），两种成分平均含量为45.23 mg/g（RSD=0.54%，n=3）。

表1 加样回收率试验结果 （n=6）

表2 因素水平表

表3 正交试验结果

表4 超临界萃取率测定结果方差分析

表5 两种成分总含量测定结果方差分析

3 讨论

超临界CO2技术应用于中药提取是中药现代研究的重要发展方向之一，该技术优点在于以液态CO2作为萃取介质，其提取物无需回收溶剂、无污染，同时具有提取温度低、时间短、提取率高等优点［3］。本文在文献［4-5］报道的基础上，采用正交设计法对中药陈皮超临界萃取进行了研究，实验以萃取率和川陈皮素、橘皮素两种有效成分的含量为指标，对萃取过程中的4个主要影响因素即：萃取时间、萃取温度、萃取压力和CO2流速进行了考察，得到的萃取工艺较为科学。

近年来随着对陈皮研究的深入，人们发现除了以橙皮苷为代表的黄酮苷类成分外，其所含的多甲氧基黄酮类成分也是陈皮中不可忽视的活性成分，这类成分具有特殊的抗肿瘤活性［6］，其中以川陈皮素和橘皮素的研究最多。从色谱图中可见这两种成分在陈皮超临界CO2萃取物中含量较高，分离度好，可作为陈皮超临界CO2萃取工艺和质量控制的指标。

实验采用UPLC 法对陈皮超临界CO2萃取物中川陈皮素、橘皮素的含量进行了同时测定。由色谱图可见，在4 min 内即可完成一次进样，而传统的HPLC 法一次进样需要近40 min［7］，可见UPLC 法对中药多成分复杂体系的分析具有快速、高效的优势。川陈皮素和橘皮素色谱峰中间还存在另外一个含量较高的成分，经查阅相关文献确定其为3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黄酮，但由于未能得到其对照品，本实验未能对其含量进行测定。

［1］Miyamoto S，Yasui Y，Tanaka T，et al.Suppressive effects of nobiletin on hyperleptinemia and colitis-related colon carcinogenesis in male ICR mice［J］.Carcinogenesis，2008，29（5）：1 057.

［2］钱士辉，王佾先，亢寿海，等.陈皮提取物体外抗肿瘤作用的研究［J］.中药材，2003，26（10）：744-746.

［3］廖传华，黄振仁.超临界CO2萃取技术与中药现代化［J］.中成药，2006，28（1）：110-113.

［4］王艳琴，王晓琴，蔺新遥.陈皮挥发油超临界二氧化碳流体萃取工艺研究［J］.甘肃中医，2007，20（7）：91-92.

［5］于莲，焦淑清，李玉环，等.陈皮挥发油超临界CO2萃取工艺的研究［J］.黑龙江医药科学，2005，28（5）：6-7.

［6］童红梅.陈皮中黄酮类化合物药理作用研究进展［J］.山西中医学院学报，2010，11（3）：75-76.

［7］郑国栋，蒋林，杨雪，等.不同贮藏年限广陈皮黄酮类成分的变化规律研究［J］.中成药，2010，32（6）：977-979.