补肾化痰方对去卵巢大鼠骨组织中BMP-2 和TGF-β1表达的影响

胡 娅，蹇顺华，向 楠

（1.长江大学医学院，湖北 荆州 430023；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种由多种原因引起的全身性骨骼疾病，它以骨组织显微结构退化，骨量减少为主要特征，导致骨的脆性增加而容易发生骨折［1］。临床上主要表现为腰背肢体疼痛，病理骨折，身体畸形，或伴有原发疾病表现。本病属于中老年人的一种退行性病变，发病率高，严重危害中老年健康，已成为老龄化社会卫生保健的突出问题。本实验通过检测去卵巢（OVX）骨质疏松症大鼠骨组织中骨形态发生蛋白2（BMP-2）和转化生长因子β1（TGFβ1）的表达水平，探究补肾化痰方的成骨机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 8 月龄雌性SD 大鼠，清洁级，由华中科技大学同济医学院提供，许可证号SCXK（鄂）2004-0007。

1.1.2 实验药物 补肾化痰方由菟丝子30 g，淫羊藿10 g，补骨脂15 g，全瓜蒌15 g，红曲12 g 和生山楂20 g 组成，生药由湖北中医药大学附属医院门诊部中药房提供，加水煎煮，过滤，并浓缩，配制成0.94 g/mL 和1.88 g/mL 两个浓度的生药混悬液，密封贮存于4 ℃冰箱备用。利维爱（南京欧加农制药有限公司，2.5 mg/片，批号：LK-4305-10）。

1.1.3 试剂与仪器 两步法抗兔免疫组化试剂盒（DAKO 公司，货号：K5007），骨形态发生蛋白2 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-1012R），转化生长因子β1抗体（美国santa cruz 公司，货号：sc-146）。JT-12J 电脑生物组织脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；KD-BM 生物组织包埋机（浙江金华市科迪仪器设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 去卵巢大鼠模型的建立和分组 50 只大鼠随机分为模型组、假手术组、西药组、中药低剂量组、中药高剂量组。除对照组外，其他各组大鼠行卵巢切除术。麻醉后，无菌条件下行背部肋下双侧卵巢切除。假手术组术式相同，但不摘除卵巢，仅切除少量卵巢周围脂肪组织。术后3 个月开始灌胃给药，中药组以补肾化痰方灌胃，低剂量组9.4 g，高剂量组18.8 g；西药组予以利维爱0.23 mg，对照组、假手术组予以等体积的生理盐水灌胃，每天1 次，给药时间为8 w。期间各组大鼠分笼常规饲养，自由饮水摄食。

1.2.2 骨组织形态学观察及BMP-2 和TGF-β1测定 取大鼠的左侧胫骨骨组织，剔除周围附着的肌肉等软组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，再于10%硝酸溶液中脱钙处理。常规石蜡包埋，切片，HE染色。显微镜下观察骨组织形态结构，免疫组化检测骨组织BMP-2 和TGF-β1水平。结果采用Image pro-plus 6.0 图像分析方法进行分析。每组内每张切片随机挑选3～5 个400 倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0 软件对每张照片进行分析，得出每张照片的累积光密度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0 统计软件进行方差分析，所有数据均以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补肾化痰方对OVX 大鼠骨组织形态学变化的影响

假手术组骨小梁粗大，形态结构完整，分布均匀，排列规则，骨小梁未见中断，骨小梁之间的间隙小；模型组与假手术组相比，骨小梁明显显得纤细，形态结构不完整，分布稀疏零乱，断裂严重，骨小梁间间距较大，出现典型的骨质疏松病理形态改变；西药组骨小梁数量较多，结构完整，排列较整齐，骨小梁未见明显中断，小梁间间隙较小，骨小梁的数量、宽度、完整性明显优于模型组，但比假手术组稍差；中药低剂量组骨小梁可见部分断裂，骨小梁连接点减少，形态结构欠完整，排列不规则，骨小梁间间距增大，骨小梁的数量、宽度、完整性优于模型组，但不如中药高剂量组、西药组和假手术组；中药高剂量组骨小梁数量较多，排列规则，少许骨小梁可见扭曲和断裂，但尚可联结成网状结构，骨小梁间间距稍大，骨小梁的数量、宽度、完整性优于模型组和中药低剂量组，但不如西药组和假手术组。

2.2 补肾化痰方对OVX 大鼠骨组织BMP-2 和TGFβ1的影响

BMP-2 和TGF-β1表达主要分布在定位于骨小梁附近的成骨细胞，在成骨细胞的胞浆中呈阳性显色。光镜下观察，模型组成骨细胞中的BMP-2 和TGF-β1表达的阳性颗粒均呈淡黄色，在胞浆内均匀分布，其他各组的阳性表达颗粒明显增多，呈棕黄色密集分布于成骨细胞的胞浆内。各组BMP-2 阳性表达：假手术组、西药组、中药低剂量组、中药高剂量组累积光密度值明显高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；中药低剂量组阳性表达低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）。TGF-β1阳性表达：与模型组相比，假手术组、西药组、中药低剂量组、中药高剂量组累积光密度值均明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠骨组织BMP-2、TGF-β1表达的累积光密度值 （±s）

表1 各组大鼠骨组织BMP-2、TGF-β1表达的累积光密度值 （±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01；与假手术组比较，2）P＜0.05

3 讨论

骨形态发生蛋白（BMPs）是一个生长分化因子家族，参与骨与软骨的形态发生过程。BMP-2 是BMPs 中活性最强的成骨诱导因子，具有强大的骨、软骨诱导活性，可以有效地促进骨折的愈合和骨缺损的修复［2］。研究证明，不表达BMP-2 的成骨细胞的前体细胞不具备分化能力，但是如果对这种前体细胞加入外源重组BMP-2 或将BMP-2 基因导入此细胞，便可促使其分化，表明成骨细胞的分化与BMP-2 基因表达密切相关。当BMP-2 表达下降时，骨髓中许多具有成骨诱导潜能的干细胞，增殖分裂明显减少，从而使成骨细胞功能减退，导致骨小梁减少，骨形成量减少，造成骨质疏松。当BMP-2 表达增强时，成骨细胞自分泌与旁分泌BMP-2 增加，促进细胞外基质钙化，促进骨组织的生长发育，维持骨代谢的平衡。BMP-2 既能直接促进成骨细胞的分化和增殖，又能促进其他成骨因子的表达，多方面促进骨形成［3］。

骨组织已发现的TGF-β 三种亚型中，以TGFβ1含量最为丰富。TGF-β1维持骨形成和骨吸收的动态平衡，是骨代谢环境中的重要影响因子之一［4］。一方面，TGF-β1可以通过抑制破骨细胞生成以及抑制成熟破骨细胞的活性来抑制骨吸收作用，从而防治骨质疏松；另一方面，TGF-β1通过刺激成骨细胞增殖，促进骨和软骨细胞胶原及基质蛋白的合成与钙化，通过刺激或抑制其他细胞因子的产生或调控其作用，来调节骨代谢，从而促进骨形成。TGF-β1既影响成骨细胞活性又影响破骨细胞活性，是骨吸收与骨形成之间有力的调节和偶联因子。

骨质疏松症属于中医“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”、“骨枯”、“骨极”的范畴，补肾法历来被作为治疗肾虚骨质疏松症的主要疗法。研究证实补肾中药能促进骨形成［5］，使OVX 骨质疏松模型大鼠产生较多的骨基质，使类骨质转变为矿化骨小梁。前期实验结果表明补肾化痰方能增加OVX 大鼠骨密度［6］，本实验提示补肾化痰方通过增强BMP-2、TGF-β1表达来调节成骨细胞和破骨细胞的平衡，改善骨密度。

［1］刘忠厚，杨定焯，朱汉民，等.中国人原发性骨质疏松症诊断标准［J］.中国骨质疏松杂志，1995，5（1）：1-3.

［2］张宏宇，赵彬，张丽彦，等.辛伐他汀对糖尿病大鼠种植体周围骨组织中骨形态发生蛋白-2 表达影响的研究［J］.中国实用口腔科杂志，2011，4（1）：28-30.

［3］Vaes B L，Deehering K J，Feijen A，et al.Comprehensive microarray analysis of bone morphogenetic protein 2 induced osteoblast differentiation resulting in the identification of novel markers for bone development［J］.J Bone Miner Res，2002，17（12）：2 106-2 118.

［4］舒晓春，朱丹华，鲁红云，等.骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中TGF-β1、BMP-2 分泌的影响［J］.中华内分泌代谢杂志，2010，26（11）：990-992.

［5］潘伟军，曾昭明，黄宏兴.补肾益精法治疗更年期妇女骨质疏松的临床观察［J］.山西中医学院学报，2006，7（4）：30-31.

［6］胡娅，向楠，蹇顺华，等.补肾化痰方对去卵巢大鼠血清ADP 和TRACP5b 的影响［J］.吉林中医药，2010，30（12）：1 101-1 102.