磷酸化缺陷型RARα1受体对人多发性骨髓瘤细胞体外增殖的影响*

郭小娟, 郑 冬△, 王安训, 李 娟, 夏 盈

(中山大学附属第一医院 1血液内科; 2口腔外科，广东 广州 510080)

1000-4718(2012)05-0816-07

2012-02-23

2012-04-01

广东省科技计划项目(No.2011B031800139)

△通讯作者 Tel: 020-87755766-8831; E-mail: zcxzd@tom.com

磷酸化缺陷型RARα1受体对人多发性骨髓瘤细胞体外增殖的影响*

郭小娟1, 郑 冬1△, 王安训2, 李 娟1, 夏 盈1

(中山大学附属第一医院1血液内科;2口腔外科，广东 广州 510080)

目的研究磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1(RARαS77A)对人多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖的影响。方法(1)RT-PCR检测U266 细胞RARα受体亚型mRNA的表达；(2)RARαS77A过表达慢病毒载体的构建，慢病毒包装，滴度测定及MM细胞转染；(3)CCK-8检测全反式维甲酸(ATRA,0～100 μmol/L)处理或RARαS77A过表达慢病毒转染后U266 细胞的增殖；(4)Western blotting检测RARαS77A过表达慢病毒转染或ATRA处理后U266 细胞增殖相关蛋白Rb和P53的表达。结果(1)U266为RARα1(+)、RARα2(-)细胞；(2)ATRA明显抑制U266 细胞增殖，其作用呈时间和剂量依赖性；RARαS77A过表达慢病毒转染48 h 后U266细胞增殖明显被抑制，抑制率为15.16%±3.84%；(3)RARαS77A过表达慢病毒转染及ATRA处理均可上调U266细胞Rb蛋白表达及下调其P53蛋白表达。结论磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1与ATRA均可通过上调Rb及下调P53表达抑制RARα1(+)、RARα2(-)的U266细胞增殖，提示降低维甲酸受体RARα1的磷酸化是ATRA抑制MM细胞增殖的一个重要作用途径。

多发性骨髓瘤； 受体，维甲酸； 磷酸化； 细胞增殖

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系统常见肿瘤，传统化疗效果较差，目前仍被认为是一种不能治愈的疾病。虽然自体造血干细胞移植术和万珂等新药的临床应用大大提高了MM患者的无病生存时间，但由于耐药的出现以及复发的不可避免，新的药物研发以及新的治疗方式的探索仍然是目前急需解决的问题。自从1985年全反式维甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)联合化疗作为急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的诱导和巩固治疗方案应用于临床,初治APL患者的完全缓解率(complete remission,CR)提高至90%～95%，5年无病生存率(disease-free survival,DFS)提升至 74%。ATRA的出现将APL从致死率最高的急性髓细胞白血病(AML)类型转变为临床预后最好的类型。自此，近年来大量的研究将ATRA应用于许多实体肿瘤上，研究报道ATRA可以诱导许多肿瘤细胞产生再分化和凋亡的作用，抑制肿瘤细胞的生长，如口腔鳞癌、乳腺癌、肺癌、胃癌以及胰腺癌等。同样，对于大多数MM细胞株，ATRA均具有抑制其生长增殖的作用[1]；对于骨髓中新鲜分离的MM细胞增殖，其抑制作用呈剂量依赖性[2]。随后大量研究发现ATRA不仅可以抑制MM细胞的增殖，同时可以促使MM细胞凋亡，其可通过调节 MM细胞的Fas抗原发挥对MM细胞增殖及诱导MM细胞凋亡，而联合抗Fas抗体可增强其抑制增殖及促凋亡作用。ATRA联合地塞米松可降低MM细胞白细胞介素-6受体(interleukin-6 receptor,IL-6R)及B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)的表达，增加地塞米松的细胞毒作用以及其促进细胞凋亡的作用，通过上调p21WAF1以及减低磷酸化Rb蛋白的表达来抑制MM细胞增殖[3]。然而维甲酸的分化综合征及高钙血症等不良反应限制了传统的维甲酸类药物的进一步发展及对MM患者的临床应用，改进和研发靶向性高、毒副作用小的维甲酸类药物成为了目前的一个研究方向。既往研究发现ATRA主要是通过维甲酸受体α(retinoic acid receptor alpha,RARα)的转录调控发挥效应的[4]，其中RARα的 转录激活作用主要通过RARα1受体AF-1区域第77位丝氨酸的磷酸化实现[5]。RARα1与cyclin H/CDK7复合物结合以及将RARα1受体氨基酸末端第77位丝氨酸磷酸化可增强RARα的反式激活作用，而ATRA通过抑制cyclin H/CDK7的表达而降低RARα1氨基酸末端第77位丝氨酸的磷酸化来发挥作用[6]。磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1可以模拟ATRA的作用诱导肿瘤细胞出现G1期阻滞从而抑制细胞增殖及诱导再分化作用[7-9]。本研究通过构建磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1 (RARαS77A)过表达的慢病毒转染MM细胞U266，研究其对MM细胞增殖的影响。

材 料 和 方 法

1细胞株及主要试剂

人胚肾细胞株293T和人MM细胞株U266均来源于ATCC，胎牛血清购于HyClone。ATRA购于Sigma;EcoRⅠ及NheⅠ限制性内切酶购于NEB;Lipofectamin2000购于Invitrogen;逆转录试剂盒、PCR试剂及Trizol购于TaKaRa;PCR引物由上海生工合成，质粒中提试剂盒及DH-5α感受态大肠杆菌购于天根，Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒购买于DOJINDO Laboratory;全蛋白提取及BCA蛋白定量试剂盒购自凯基生物，兔抗人P53单克隆抗体及鼠抗人Rb单克隆抗体购于Cell Signaling Technology,兔抗人GAPDH单克隆抗体及IgG/HRP Ⅱ抗购于博奥森，PVDF膜(0.45 μm)为Millipore产品。

2细胞培养

293T和U266细胞分别于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM和RPMI-1640完全培养基中(Gibco)，37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中恒温培养， U266细胞浓度维持在(5～10)×1018/L，所有细胞长到对数期即可用于实验研究。

3RT-PCR检测U266细胞RARα受体亚型(RARα1及RARα2)的表达情况

离心收集未干预的对数生长期U266细胞，提取细胞总RNA并将其逆转录为cDNA, 引物序列如表1所示，其中β-actin (196 bp)为用于标准化各个样本cDNA含量的管家基因。PCR循环过程如下：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 1 min,61 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30个循环，72 ℃ 5 min。收集PCR产物于1.5% 琼脂糖凝胶行电泳分析(100 V 30 min), 将凝胶取出后于紫外凝胶成像系统成像分析。

表1 RT-PCR引物序列

4磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1过表达质粒的构建及慢病毒包装

本研究的磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1过表达载体为上海吉玛公司构建，具体构建过程如下：提取RARα1(+)MM细胞株U266总RNA并逆转录成cDNA, RT-PCR反应后经过DNA胶回收获取RARα1模板cDNA，测序验证后通过PCR扩增反应在已获取的RARα1目的基因序列两端加入酶切位点EcoRⅠ及NheⅠ，将上述PCR产物双酶切获得含酶切位点RARα1模板cDNA，通过T4DNA连接酶将上述胶回收产物连接线性化空质粒构建质粒pGLV1-CMV-RARα1，测序验证；通过点突变的方法(Stratagene)将所购建质粒RARα1第77位编码丝氨酸的密码子TCG突变成GCG，挑选阳性克隆进行核甘酸测序分析，得到突变型RARα1受体pGLV1-CMV-RARαS77A质粒，RARαS77A编码蛋白的磷酸化缺陷验证在Rochette-Egly等的研究中通过[32P]放射性同位素标记等方法证实[5, 7, 10]。构建含无关序列的带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的慢病毒穿梭质粒为对照。将构建含RARαS77A目的基因的慢病毒穿梭质粒行双酶切反应验证构建质粒的正确性后将穿梭质粒pGLV1-CMV-RARαS77A 或者pGLV1-CMV-NC-EGFP 40 μg, 包装质粒混合物(pG-p1-VSVG,PG-P3-RRE,PG-P2-RRE)42 μg及适量Lipofectamine 2000转染试剂混匀加入DMEM完全培养基中共同转染293T细胞，72 h收集培养液上清离心超滤即可得到病毒纯化液。

5病毒滴度测定及靶细胞转染

将293T 细胞接种于96孔板，5×103cells/well，第2 d将病毒液10倍稀释呈3～5个梯度，并加入终浓度5 mg/L 聚凝胺(polybrene)，移去旧培养液加入稀释好的病毒液100 μL, 5% CO2、37 ℃培养过夜，第3 d换液，第4 d根据细胞状态将细胞分出1/3～1/5继续培养，第5 d荧光显微镜下观察细胞转染效率，结合稀释倍数估计病毒滴度。将U266细胞分5×103cells/well 及1×104cells/well 2个浓度接种于96孔板, 分别用MOI=1∶1、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100 5个梯度的表达EGFP的对照病毒侵染，加入polybrene(5 mg/L)增强病毒感染力，培养24、48、72、96 h后荧光显微镜下观察转染效率，并选择荧光表达高的转染组行流式细胞术检测EGFP阳性表达率。本研究中选取MOI=1∶50，并加用polybrene(5 mg/L)对U266细胞进行侵染(96孔板 1×104cells/well，12孔板 2×105cells/well)，慢病毒转染后24 h培养液加倍，转染后48 h 收集细胞行增殖及Western blotting实验。

6ATRA处理U266细胞

将ATRA粉末溶解于无水乙醇配制浓度为104μmol/L的储存液, RPMI-1640培养基将其稀释至0～100 μmol/L后加入U266细胞实验组(96孔板中 2×104cells/well，12孔板 2×105cells/well)进行药物干预，≤ 1‰无水乙醇设为对照组，加药完毕将培养板放置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内避光培养。

7CCK8检测U266细胞增殖

取对数期U266细胞接种于96孔板，2×104cells/well ，加药处理后于37 ℃、5% CO2培养箱中分别避光培养24、48、72、96 h，以不含细胞但含1 μmol/L ATRA的RPMI-1640培养基为空白组；慢病毒转染组分实验组(RARαS77A过表达的慢病毒转染组)和对照组(对照慢病毒转染组)，细胞数为1×104cells/well，转染后分别培养48 h及72 h，以不含细胞的RPMI-1640培养基为空白组。ATRA处理组及慢病毒转染组每组均设3个复孔，在处理好的细胞中加入CCK-8试剂(10 μL/well)，培养箱中避光孵育1～4 h，酶标仪450 nm 波长下测试每个样孔的吸光度值(A)，根据公式计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate,IR)。

IR(%)=100%-(对照组A-空白组A)/(实验组A-空白组A)×100%。

8Westernblotting检测U266细胞增殖相关蛋白的表达

提取12孔板经过ATRA(0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)处理及慢病毒转染48 h后的U266细胞蛋白，测蛋白浓度、定量、变性。配制12%的蛋白分离胶及3.75%浓缩胶，蛋白上样及电泳后转移至PVDF膜中，0.5% 脱脂奶粉封闭 1 h, 分次加入0.5%BSA 稀释的抗体P53(1∶500)，Rb (1∶500)4 ℃孵育12～16 h,洗膜，加入0.5% BSA稀释的Ⅱ抗(1∶3 000),室温孵育1 h,洗膜，取出放入曝光暗盒，至暗房加ECL发光液于膜上反应，压胶片，曝光，显影，定影，再将膜取出用Striping buffer 洗脱后，重复上述封闭步骤，加入内参照抗体GAPDH(1∶1 000)同上显影，定影。用 Quantity One(Bio-Rad) 进行灰度分析。

9统计学处理

结 果

1U266细胞中RARα受体亚型(RARα1及RARα2)的表达

所用引物RARα1、RARα2及β-actin PCR产物分别为200 bp、300 bp和196 bp，RT-PCR检测U266细胞为RARα1(+)、RARα2(-)的人MM细胞，见图1。

Figure 1. The expression of RARα1 and RARα2 mRNA in human multiple myeloma U266 cells detected by RT-PCR.

图1RT-PCR检测U266细胞株中RARα1和RARα2mRNA的表达

2磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1过表达质粒的验证

pGLV1-CMV-RARαS77A质粒扩增抽提后用限制性内切酶EcoRⅠ以及NheⅠ进行双酶切反应，酶切产物电泳后凝胶成像图谱见图2(RARαS77A为1 376 bp)，酶切质粒中可见与目的基因片段大小一致的清晰条带，未酶切质粒中只有一单一片段。

Figure 2. The detection of RARαS77A fragment by double-enzyme cleavage analysis in the recombinant plasmid (pGLV1-CMV-RARαS77A). M: marker;Lane 1:lentivirus expression plasmid digested by endonuclease;Lane 2:the complete lentivirus expression plasmid.

图2双酶切反应验证在重组质粒PGLV1-CMV-RARαS77A中的RARαS77A片段

3ATRA对U266细胞增殖的影响

不同浓度的ATRA(0～100 μmol/L)处理48 h后, U266细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)，见图3A，半数抑制浓度(IC50)为 62.65 μmol/L，药物浓度增加，细胞增殖抑制率相应升高。用4个浓度ATRA(0 μmol/L、 1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)分别处理24、48、72和96 h 后，ATRA对U266细胞增殖抑制率伴随处理时间延长而升高，见图3B。

图3ATRA对U266细胞增殖的影响

4慢病毒转染验证以及RARαS77A过表达慢病毒转染对U266细胞增殖的影响

病毒转染U266细胞48 h后可见大量荧光表达，流式细胞术检测U266细胞中EGFP阳性表达率为52.66%，见图4A。经过RARαS77A过表达慢病毒转染48 h后，U266细胞的增殖受到明显抑制(P<0.01)，其抑制率为15.16%±3.84%，见图4B。

5磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1(RARαS77A)及ATRA对U266细胞增殖相关蛋白表达的影响

ATRA处理48 h后，U266细胞中Rb蛋白表达较对照组升高(图5A、6A)(P<0.05)， P53蛋白的表达较对照组下降(图5C、6C)(P<0.05)。与对照慢病毒转染组比较，在RARαS77A过表达慢病毒转染48 h后的U266细胞中同样检测到Rb蛋白表达升高(图5B、6B)(P<0.05)，P53蛋白表达水平下降(图5D、6D)(P<0.05)。以上结果证明磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1与ATRA一样均通过上调Rb蛋白表达、下调P53的表达实现对U266细胞增殖的抑制作用。

讨 论

维甲酸(retinoic acid,RA)是视黄醇(即维生素A)的活性分子衍生物，是一种普遍存在于几乎所有细胞中的信号分子，其对胚胎的发育、器官的生成、组织的恒定以及细胞的增殖分化及凋亡有深远的影响[11]，在癌症治疗上维甲酸可以促进肿瘤细胞的分化和/或诱导对药物联合作用的敏感蛋白表达，是目前临床上应用最为成功的分化诱导剂。

图4RARαS77A慢病毒转染效率的评估及其对U266细胞增殖的影响

维甲酸主要通过作用于RARα发生作用，RARα1及RARα2为大量存在于人体的两种主要的

RARα的亚型，其中RARα1在各种组织中的表达水平相似，而RARα2为组织特异性表达，其表达水平随着RA及G-CSF的诱导分化作用而上调。曾有研究者对所收治的80例初治的MM病人进行RARα亚型的检测，发现RARα1普遍存在于所有病人中，而RARα2(+)仅占32.5%，RARα2的表达与多发性骨髓瘤的疾病进展以及ATRA的治疗效果紧密相关，表达RARα2的患者总生存时间较不表达者短；高表达的RARα2刺激了STAT及MEK/Erk途径，敲除其的表达将抑制MM细胞的增殖及促进其凋亡，因此增加RARα2的表达可以增加RARα2表达阴性的MM细胞株对ATRA药物作用的敏感性[12]。而对于本研究中细胞株U266均为RARα2(-)表达的细胞株，磷酸化缺陷型RARα1受体与ATRA一样均可以抑制其细胞增殖，提示在缺少RARα2表达的细胞中ATRA主要通过降低RARα1的磷酸化来发挥抑制MM细胞增殖的作用。

RARα作为一种磷酸化蛋白，正常情况下增强其磷酸化水平可促进细胞的增殖，在细胞核受体途径进行信号转导发挥转录激活作用。RARα1受体通过与cyclin H及 CDK 结合导致RARα1受体AF-1反式激活区域的第77位丝氨酸磷酸化可增强RARα1受体的转录激活作用[5, 13]，增强细胞增殖能力，磷酸化缺陷型的RARα1受体可以模拟维甲酸的作用，对EGFR产生作用，介导AP-1的表达，诱导细胞G1期阻滞从而减少细胞进入S期的量达到抑制肿瘤细胞的增殖[8]。研究显示ATRA通过抑制CAK复合物(cyclinH, CDK,MAT1)活性抑制RARα1受体磷酸化后可以抑制肿瘤细胞增殖及促进癌细胞再分化，将磷酸化缺陷型RARα1受体(RARαS77A)整合到肿瘤细胞内同样可以发挥抑制肿瘤细胞增殖及促进癌细胞再分化的作用，其作用在急性早幼粒白血病、骨肉瘤及神经母细胞瘤中已得到证实[9, 10, 14]。

Figure 5. The expression of Rb and P53 in U266 cells treated with ATRA or transfected with lentivirus RARαS77A detected by Western blotting. A：Rb expression in U266 cells treated with ATRA；B: Rb expression in U266 cells transfected with lentivirus RARαS77A; C:P53 expression in U266 cells treated with ATRA ; D: P53 expression in U266 cells transfected with lentivirus RARαS77A .

图5RARαS77A过表达慢病毒转染或ATRA处理后U266细胞Rb和P53蛋白的表达

图6RARαS77A过表达慢病毒转染或ATRA处理后U266细胞Rb和P53蛋白的表达

本研究将磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1(RARαS77A)过表达慢病毒转染人MM细胞U266中，发现其可以模拟ATRA的作用抑制U266细胞增殖，且磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1与ATRA一样在作用U266细胞后均可出现Rb蛋白表达的升高及P53蛋白表达的下降。既往研究已经证实Rb是一种抑癌基因，其表达升高可以抑制肿瘤的生长和形成，而正常的p53基因也是一种肿瘤抑制基因，但在恶性肿瘤细胞中50%以上的p53基因会出现该基因的突变，成为了一种肿瘤的促进因子，而本研究U266细胞中的p53基因是属于突变型的[15]。因此本实验发现磷酸化缺陷型维甲酸受体RARα1可以模拟ATRA抑制MM细胞增殖，其作用均是通过上调Rb蛋白表达及下调P53蛋白表达来实现的。本实验结果进一步证实在ATRA抑制MM细胞增殖的作用中，降低维甲酸受体RARα1的磷酸化是重要的作用途径，对维甲酸相关药物的研发有重要意义。

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Effectsofphosphorylation-defectiveretinoicacidreceptorα1onproli-ferationofhumanmultiplemyelomacellsinvitro

GUO Xiao-juan1, ZHENG Dong1, WANG An-xun2, LI Juan1, XIA Ying1

(1DepartmentofHematology;2DepartmentofOralSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SUNYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zcxzd@tom.com)

AIM: To investigate the effect of phosphorylation-defective retinoic acid receptor α1 (RARα1) on the proliferation of human multiple myeloma cells.METHODSThe mRNA expression of RARα subtypes in U266 cells was detected by RT-PCR. Lentiviral plasmid construction, viral production, titer determination and cell transfection were carried out by the general methods of molecular biology. Proliferation analysis was performed with CCK-8 assay. The U266 cells were treated with all-transretinoic acid (ATRA,0～100 μmol/L) or transfected with lentivirus RARαS77A. The expression levels of proliferation-related proteins, P53 and Rb, in U266 cells treated with ATRA or transfected with lentivirus RARαS77A were detected by Western blotting.RESULTSRARα1 was positively expressed in U266 cells and RARα2 expression was negative. ATRA significantly inhibited the proliferation of U266 cells in a dose- and time-dependent manner. Proliferation of U266 cells was significantly inhibited 48 h after transfection with lentivirus RARαS77A, and the inhibitory rate was 15.16%±3.84%. The up-regulated expression of Rb and down-regulated expression of P53 were detected in U266 cells not only in the cells treated with ATRA, but also in the cells transfected with lentivirus RARαS77A.CONCLUSIONPhosphorylation-defective RARα1 (RARαS77A) mimics the growth inhibitory effect of ATRA on U266 cells that express RARα1 (+) and RARα2 (-) via down-regulating the expression of P53 and up-regulating the expression of Rb, suggesting that the antiproliferative effect of ATRA is mainly mediated by decreasing the phosphorylation of RARα1.

Multiple myeloma; Receptors, retinoic acid; Phosphorylation; Cell proliferation

R453.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.009