温郁金二萜类化合物C对脂多糖诱导的人胃腺癌SGC7901细胞内NF-κB信号通路的影响

盛桂琴， 吕 宾, 金海峰

(1绍兴县中心医院消化科，浙江 绍兴 312030；2浙江中医药大学附属第一医院消化科，浙江 杭州 310006)

1000-4718(2012)03-0556-04

2011-02-24

2011-12-19

△通讯作者 Tel:0571-87032028 ;E-mail：lvbin@medmail.com.cn

温郁金二萜类化合物C对脂多糖诱导的人胃腺癌SGC7901细胞内NF-κB信号通路的影响

盛桂琴1， 吕 宾2△, 金海峰2

(1绍兴县中心医院消化科，浙江 绍兴 312030；2浙江中医药大学附属第一医院消化科，浙江 杭州 310006)

目的研究温郁金二萜类化合物C(RC)对脂多糖诱导的人胃腺癌SGC7901细胞核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活性影响。方法以10 mg/L脂多糖(LPS)刺激体外培养的SGC7901细胞建立炎症模型，设正常对照组、LPS刺激组、RC预干预组(RC干预后以LPS刺激)。蛋白质印迹法检测IKK、p-p65、p65和p-IκBα蛋白表达，凝胶迁移阻滞实验检测p65与DNA结合活性。结果与炎症模型组比较，经温郁金二萜类化合物干预后，细胞中的IKK、p-p65、p65和p-IκBα蛋白表达均减少；入核p65蛋白与DNA结合活性减弱。结论温郁金二萜类化合物通过抑制核因子-κB信号通路起抗炎作用。

温郁金； 二萜类； NF-κB； SGC7901细胞

中药温郁金具有行气化瘀，清心解郁，利胆退黄作用，现代药理及临床研究表明，从温郁金中提取的多种有效成份具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理活性[1]。革兰氏阴性菌内毒素的脂多糖成份是引起慢性炎症、败血症休克的主要因素。脂多糖持续刺激机体细胞系统，被宿主脂多糖结构识别受体识别，从而激活一系列信号转导通路，诱发细胞因子的转录表达，产生炎症级联反应。核因子-κB激活途径是最重要、研究最多、最常见的炎症通路，亦是免疫应答、炎症反应和机体发育过程中的关键转录因子，它在细胞中的定位与活力受到严格的调控。我们前期的实验结果表明从温郁金中提取的二萜类化合物能抑制脂多糖诱导SGC7901细胞的致炎作用。但其抗炎机制有待进一步深入研究。我们以脂多糖诱导SGC7901细胞为炎症模型，进一步探讨温郁金二萜类化合物C的抗炎作用及机制。

材 料 和 方 法

1材料和仪器

温郁金二萜类化合物C由本单位与浙江大学药学院合作提取，分子量380，分子式为C22H36O5以二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 g/L，储存于-20 ℃，用时按需要稀释。人胃腺癌SGC7901细胞株购自中科院上海细胞库。NF-κB pathway sample kit(编号为9936)[包括核因子κB抑制蛋白激酶α(IκB kinase α，IKKα)抗体、IKKβ抗体、p65及p-p65抗体、IκBα及其磷酸化蛋白抗体]为Cell Signaling产品，Ⅱ抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和RPMI-1640购自杭州达文生物有限公司。新生牛血清、杭州四季青公司产品；溶解温郁金化合物C的DMSO和LPS为Sigma产品。核蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。凝胶迁移阻滞试剂盒(编号为20148)为Thermo，尼龙膜和p65生物素标记探针(GS056B)购自上海碧云天生物技术有限公司。

CO2培养箱(Thermo)，生物安全操作柜(Thermo)，Western blotting电泳仪和电转仪购自Bio-Rad。

2方法

2.1温郁金二萜类化合物C细胞毒性检测(MTT法) SGC-7901细胞接种于96孔板中，接种密度2.5×108/L ，每孔200 μL，24 h细胞贴壁后弃去上清，加含不同浓度化合物C的培养液(0、10、20、40、60、80 mg/L)作用24 h，在终止细胞培养前4 h加入20 μL MTT液，终止细胞培养后加入150 μL DMSO于酶标仪测定A490值，抑制率=1-(化合物C组A值-DMSOA值/对照组A值-DMSOA值)求出药物IC5的值后，进入后续实验。

2.2细胞核蛋白及总蛋白提取 将处于对数生长期的SGC7901细胞接种于面积为6 cm2的培养皿中，当细胞融合至培养皿面积的80%时进行如下处理。设正常对照组(1‰ DMSO)；LPS组(10 mg/L LPS分别刺激5 min、10 min、15 min、30 min、60 min)；温郁金化合物(RC)+LPS组(浓度为10 mg/L的RC预处理16 h后，再加入LPS 10 mg/L分别刺激5 min、10 min、15 min、30 min、60 min)。收集细胞，按核蛋白及总蛋白提取操作说明提取蛋白，BCA法测蛋白浓度，保存于-80℃。

2.3Western blotting 方法检测胞浆中p-IκBα、IKKα、IKKβ，细胞核p-p65蛋白及总蛋白中p65蛋白表达 取50 μg蛋白，煮沸变性后进行十二磺基硫酸钠/聚丙烯酰胺电泳，转移至硝酸纤维素膜。加入适量上述抗体及内参actin多克隆抗体，室温下旋转孵育2.5 h。加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温下孵育1 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次。结果用ECL-Plus化学发光试剂盒检测，以凝胶成像系统ChemiDocXRS曝光摄像，Ⅰ抗稀释度为1∶1 000，Ⅱ抗稀释度为1∶2 000。

2.4凝胶迁移阻滞(electrophoretic mobility shift assay ，EMSA)实验检测入核p65与DNA结合活性 细胞分组设正常对照组(1‰ DMSO)；LPS组(10 mg/L LPS刺激60 min)；RC+LPS组(10 mg/L RC预处理细胞16 h后，再加入LPS 10 mg/L刺激60 min)；RC组(RC作用16 h)。核蛋白提取同前,参照EMSA试剂盒进行操作，5 μg细胞核提取物加入适量结合反应液、Poly d(I-C)和双蒸水室温静置10 min，加入适量生物素标记探针(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)使总反应体系为20 μL，继续室温静置20 min后，进行6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至尼龙膜上，紫外灯下交联固定DNA，经化学发光反应，洗膜后将膜置于凝胶图像系统进行扫描。

2.5灰度值检测 用Adobe Photoshop 7.0软件来处理，进行各实验组条带与对照组条带灰度值分析，目的条带与内参照条带代表目的蛋白表达水平，各组目的条带灰度值与内参条带灰度值比表示目的蛋白相对表达量。

3统计学处理

结 果

1温郁金化合物C细胞毒实验

温郁金化合物C对SGC7901细胞生长抑制随着浓度的增加，抑制作用逐渐明显，其50%的抑制浓度是38．43 mg/L，IC5值(非细胞毒剂量)是10.21 mg/L，取10 mg/L进行实验。

2WesternBlotting方法检测胞浆中p-IκBα、IKKα、IKKβ，细胞核p-p65蛋白及总蛋白中p65蛋白表达

细胞经LPS刺激后，p65和IκBα蛋白迅速发生磷酸化，在5 min时点可见明显磷酸化表达，但在较短时间内总p65蛋白、IKKα、IKKβ水平无明显改变，表明NF-κB信号通路被激活。细胞经温郁金二萜类化合物C预处理后，能显著抑制LPS对细胞p65、IκBα蛋白的磷酸化作用，细胞总p65蛋白、IKKα、IKKβ蛋白表达下降。表明化合物RC能抑制LPS对NF-κB信号通路的激活作用，见图1。

3EMSA检测细胞核内p65蛋白与DNA结合活性影响

正常对照组及温郁金二萜类化合物组仅检测到极少量的有活性的p65蛋白，表明温郁金二萜类化合物不能激活p65；经LPS刺激后有活性的p65明显增加，但经温郁金干预后，再以LPS刺激细胞，p65活性又明显降低,见图2。

讨 论

由炎症介导的各种病理损伤目前尚无很好的治疗方法。NF-κB是促炎症基因表达的“枢纽”之一，可诱导细胞因子、趋化因子、黏附因子等的表达[2]。NF-κB的不适当激活是引起炎症损伤的关键步骤，亦是目前筛选中药成份中最具潜力的抗炎靶点，应用NF-κB抑制剂以减少炎症介质的产生成为治疗炎症的新思路。NF-κB存在于多种细胞中，主要以p50/p65异源二聚体形式存在。静息状态下，NF-κB以二聚体与其抑制蛋白(IκB)形成三聚体存在于细胞质中，当细胞经LPS、白细胞介素1、肿瘤坏死因子等致炎因子作用，经一系列的级联反应， IKKs被激活，导致IκB磷酸化、泛素化，最终被26S蛋白酶体降解。IκB降解后暴露出p50的DNA结合位点和p65的参与基因转录的起始调节位点，二聚体进入细胞核调节特异基因的转录。这是NF-κB活化的经典途径。亦有研究表明NF-κB活化还有其它途径，如p65自身磷酸化[3]，入核的p65在细胞核内也受到复杂的调节，影响其转录活力的强度、持续性和特异性等，王琛等发现一种UXT蛋白具有促进NF-κB 驻留在细胞核内，帮助形成并稳定转录起始复合物的作用[4]。

我们前期的实验结果表明，以脂多糖刺激SGC7901细胞能产生大量的炎症因子，而经温郁金二萜类化合物C预处理细胞后，再以脂多糖刺激细胞，能明显减轻炎症因子的释放。

图1化合物RC对LPS激活的SGC7901细胞NF-κB信号通路蛋白表达的影响

图2SGC7901细胞中活化p65蛋白的表达

而本实验结果表明，LPS刺激SGC7901细胞后IκBα迅速磷酸化，表明其上游IKKs被激活，IKKs包括催化亚基(IKKα、IKKβ)和调节亚基(IKKγ)，而IKKα和IKKβ的量无明显改变。但经温郁金化合物干预后，IκBα磷酸化明显受到抑制(详见图1)，IKKα和IKKβ的表达量减少。经由LPS、TNF、IL-1介导的NF-κB激活，有研究者采用基因敲除方法证明起激活作用的是IKKβ而非IKKα[5]，亦有研究表明二者在IκBα的活化上起联合促进作用[6]，结果不同考虑是否与细胞种属不同有关。我们的实验结果表明，在LPS刺激的SGC7901细胞中，IκBα磷酸化有可能同时受其上游激酶的量与活性影响，而温郁金二萜类化合物C是通过减少IKKα和IKKβ的量及改变二者的活性起作用。在LPS刺激SGC7901细胞的实验中，p65蛋白也是迅速发生磷酸化的，但其总量无改变，而经温郁金化合物C干预后p65磷酸化受到抑制，表明温郁金化合物C可能直接抑制p65磷酸化，但亦有可能通过IKKs途径来抑制p65磷酸化，因为IKKs蛋白量发生了改变。Sakurai等[7]报道，过表达的IKKα或IKKβ能直接诱导p65磷酸化。

入核的p65只有与DNA结合才能发挥作用，否则只能被降解或重新回到细胞浆中，而p65磷酸化、乙酰化在DNA结合性及反式激活上起主要作用[7]。本实验中，LPS组NF-κB的DNA结合活性最强，而温郁金化合物C能减弱LPS的NF-κB与DNA的结合活性。但温郁金化合物究竞是通过何种方式削弱入核的p65与DNA结合力仍需进一步阐明。

[1] 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部) [M]．2005年版.北京：化学工业出版社，2005．279.

[2] 宋祖军，王少波，王 琦，等. NF-κB研究进展[J].世界急危重病医学杂志，2007，4(1)：1693-1697.

[3] Prajapati S,Gaynor RB. Regulation of IκB kinase (IKK)γ/NEMO function by IKKβ-mediated phosphorylation[J]. J Biol Chem,2002，277(27):24331-24339.

[4] Sun S,Tang Y,Lou X,et al. UXT is a novel and essential cofactor in the NF-κB transcriptional enhanceosome[J].J Cell Biol, 2007,178(2):231-244.

[5] Li Q, Estepa G,Memet S, et al. Complete lack of NF-κB activity in IKK1 and IKK2 double-deficient mice: additional defect in neurulation[J]. Genes Dev,2000, 14(14):1729-1733.

[6] Lee FS，Peters RT，Dang LC，et al. MEKK1 activates both IκB kinase α and IκB kinase β [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95 (16):9319-9324.

[7] Sakurai H，Chiba H，Miyoshi H，et al. 1999, IκB kinases phosphorylate NF-κB p65 subunit on serine 536 in the transactivation domain[J]. J Biol Chem，1999， 274(43):30353-30356.

EffectsofditerpenoidCfrometherextractofRadixCurcumaeonnuclearfactor-κBactivityinLPS-inducedhumangastricadenocarcinomaSGC7901cells

SHENG Gui-qin1, LÜ Bin2, JIN Hai-feng2

(1DepartmentofGastroenterology,CentralHospitalofShaoxingCounty,Shaoxing312030,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China.E-mail:lvbin@medmail.com.cn)

AIM: To observe the effects of diterpenoid C from ether extract ofRadixCurcumae(RC) on the activity of nuclear factor-κB in human gastric adenocarcinoma SGC7901 cells stimulated with lipopolysaccharide (LPS).METHODSSGC7901 cells were normally cultured, induced by LPS, or treated with LPS plus RC. The protein expression of IKKα, IKKβ, p65, phosphorylated p65 and phosphorylated IκBα was assayed by Western blotting. NF- κB DNA binding activity was determined by electrophoretic mobility shift assay.RESULTSRC reduced the protein expression of IKKα, IKKβ, p65, phosphorylated p65 and phosphorylated IκBα induced by LPS. NF-κB DNA binding activity increased much greatly by LPS stimulation, while RC resisted the action of LPS.CONCLUSIONRC may attenuate the secretion of inflammatory cytokines by inhibiting the activation of NF-κB signaling pathway.

RadixCurcumae; Diterpenes; NF-kappa B; SGC7901 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.032