Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用*

王舒阳， 韩 瑞， 张广宇， 王翠琴， 彭 越， 鲁晶晶， 彭 涛， 贾延劼

(郑州大学第一附属医院神经内科, 河南 郑州 450052)

1000-4718(2012)03-0385-08

2011-10-13

2011-11-28

国家自然科学基金资助项目(No.30770758；No.81071114)

△通讯作者 Tel：0371-66295112; E-mail:jiayanjie1971@yahoo.com.cn

·论著·

Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用*

王舒阳， 韩 瑞， 张广宇， 王翠琴， 彭 越， 鲁晶晶， 彭 涛， 贾延劼△

(郑州大学第一附属医院神经内科, 河南 郑州 450052)

目的探讨Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元中的作用。方法构建大鼠Oct3/4慢病毒载体(Oct3/4-LV)并感染大鼠MSCs；实验分为感染组(感染Oct3/4-LV)、阴性对照组(感染FU-PGC-NC-LV)和未感染组3组；采用β-巯基乙醇诱导各组大鼠MSCs分化为神经元。倒置荧光显微镜下观察MSCs感染后形态学变化；MTT法检测细胞存活率；免疫细胞化学法检测神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白 2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 和Oct3/4的表达变化；Western blotting法检测MAP-2和Oct3/4蛋白的表达变化；RT-PCR法检测MAP-2和Oct3/4 mRNA的表达变化。结果(1)阳性克隆PCR证明大鼠Oct3/4慢病毒载体构建成功，孔稀释法测定病毒滴度为2×1011TU/L。(2)倒置显微镜下观察大鼠Oct3/4慢病毒载体感染成功，感染复数(MOI)值为10，感染48 h时感染率最高，荧光表达最强；感染率可达83.4%±2.2%。感染组中，MSCs形态发生变化；MTT提示感染组细胞存活率显著降低(P<0.05)。(3)β-巯基乙醇可以诱导大鼠MSCs向神经元分化，其中以感染组诱导效果最佳，具有比较典型的神经元形态，NSE和MAP-2的表达率与其它各组相比显著增高(P<0.05)。(4)感染组与其它各组同时点的Oct3/4表达相比均显著增高(P<0.01)。并且随着诱导时间的延长，各组Oct3/4表达持续减少，诱导后5 h与诱导前相比存在显著差异(P<0.05)。结论Oct3/4在大鼠MSCs分化为神经元的过程中可能起到了重要的调控作用。

Oct3/4； 骨髓间充质干细胞； 神经元； 慢病毒

Oct3/4是POU域家族转录因子中的一员，主要表达于胚胎干细胞及生殖细胞中，是胚胎干细胞多潜能性的维持因子和生殖系细胞的调控因子，是目前已知的与胚胎发育全能性相关的重要转录因子，是哺乳动物体内全能性胚胎干细胞的标志物[1]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞，在特定条件下可以向神经元等分化[2]，但具体分化机制尚不清楚。Niwa等[3]指出Oct3/4对细胞分化的控制是剂量依赖性的,其mRNA转录水平,或者说蛋白表达水平的不同可能是维持细胞不同的分化状态的主要因素，并且在诱导胚胎干细胞向神经元分化过程中，Oct3/4的表达水平总是与神经发生能力相对应，经过连续传代，Oct3/4的含量持续减少，神经发生能力也随之降低。那么Oct3/4是否在MSCs向神经元分化过程中起作用尚不清楚。本研究构建Oct3/4基因慢病毒载体，将其感染大鼠MSCs，然后观察Oct3/4在大鼠MSCs在诱导分化为神经元过程中的表达变化，探讨Oct3/4在大鼠MSCs横向分化为神经元中作用。

材 料 和 方 法

1细胞来源

SPF级Wistar大鼠股骨中分离提取MSCs，连续传10代以上，液氮冻存，实验前常规复苏。其中SPF级Wistar大鼠，雌雄不限，150～200g，由河南省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(豫) 2005-0001。293T细胞由郑州大学生物化学教研室惠赠。

2主要试剂

AgeI购自NEB；In-FusionTMPCR Cloning Kit购自Clontech；pGC-FU载体和病毒包装3个质粒：pGC-LV载体、pHelper 1.0 载体和 pHelper 2.0 载体均购自上海吉凯基因化学有限公司；DMEM、Opti-MEM液体培养基、胎牛血清和Lipofectamine 2000购自Invitrogen；Oct3/4(Oct3/4 H-134，sc-9801)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE H-300，sc-15343)、微管相关蛋白 2(microtubulin-associated protein 2，MAP-2，sc-20172)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP H-50，sc-9065)兔抗多克隆抗体购自Santa Cruz；Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)购自碧云天公司；RNeasy Mini试剂盒、Qiagen® OneStep RT-PCR试剂盒购自Qiagen；凝聚胺(polybrene)、多聚赖氨酸、噻唑蓝(MTT)购自Sigma；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由上海吉凯基因技术有限公司根据设计合成，见表1。

表1 引物序列

3主要方法

3.1Oct3/4慢病毒载体的构建

3.1.1目的基因的获取及慢病毒载体质粒的构建 首先按照NCBI数据库中查找的Oct3/4(Gene ID: 18999)的序列，设计含有AgeI酶切位点的引物序列。上述设计引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳分离纯化。应用AgeI酶将pGC-FU 载体及纯化的PCR产物分别进行酶切消化，转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆PCR鉴定。

3.1.2慢病毒的包装、浓缩及测定 感染前24 h，以6×108/L密度将293T细胞接种于15 cm2细胞培养皿，细胞密度达70%～80%时可用于转染。常规将各DNA溶液(pGC-LV 载体20 μg，pHelper 1.0载体15 μg，pHelper 2.0载体10 μg)与 Lipofectamine 2000混合，室温下转染293T细胞，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养8 h后，转入含10%血清的细胞培养基37 ℃、5%CO2继续培养48 h。离心收集转染后的293T细胞上清液，分装后-80 ℃保存。同样方法制备仅含GFP报告基因的阴性对照慢病毒载体。采用孔稀释法进行病毒滴度测定，倒置荧光显微镜下观察感染后细胞GFP表达情况。

3.1.3感染复数(multiply of infection，MOI)的测定 参考我们的方法[4]，倒置荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况，计数荧光阳性细胞的百分比。

3.2大鼠MSCs感染及实验分组 感染前1d，取培养10代以上的大鼠MSCs，以2×109/L的密度接种至24孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。感染时，每孔细胞中加入含有Oct3/4-LV病毒液，以最适MOI值进行感染；阴性对照组加入仅含FU-PGC-NC-LV的病毒液，以相同的MOI值进行感染。

根据感染情况将同时点的MSCs细胞分为3组，感染组：感染Oct3/4-LV，即含有Oct3/4慢病毒和GFP；阴性对照组：感染FU-PGC-NC-LV，即只含有GFP；未感染组：不感染慢病毒，其它培养条件同感染组。在倒置显微镜下观察感染后24、48、72、96 h细胞形态学变化及GFP荧光表达情况，评价细胞感染效率。MTT比色法评价各组细胞存活率[4]，在酶标仪570 nm处读取各组的吸光度值(A)。

3.3体外诱导MSCs分化为神经元 取各组细胞进行诱导实验。参考我们的方法[4]，DMEM完全培养基，D-Hanks’液清洗3次，加入预诱导液(DMEM培养基+10%胎牛血清+1 mmol/L β-巯基乙醇)置于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。预诱导后，加入诱导液(DMEM培养基，5～10 mmol/L β-巯基乙醇)，37 ℃、5% CO2条件下培养5 h。

3.4免疫细胞化学染色法 将各组细胞用PBS清洗之后，迅速经 4%多聚甲醛的固定液中于 4 ℃固定过夜，0.2% Triton X-100处理10min，并用封闭液封闭1 h。然后分别用Oct3/4抗体(2.0 mg/L)、NSE抗体(1.0 mg/L)、MAP-2抗体(1.0 mg/L)和GFAP抗体(1.0 mg/L)4 ℃孵育 24 h。用PBS 洗3遍后，用Cy3标记山羊抗兔IgG(1∶200)在室温下进行染色标记，DAPI复染后，观察。

细胞图像通过显微镜用× 20摄取。每组独立的实验都会采集超过30个区域的细胞。而且，在明视野下所采集的每幅图像都尽量包含相同的细胞数目。应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析各实验组的荧光图片单个细胞的累积吸光度值，进行统计学分析。

3.5Western blotting 分别收集各组细胞，PBS液漂洗1遍，按照106加入100 μL双去污裂解液(10 mmol/L pH 6.8 Tris-HCl，1%SDS，1%Triton-X100，100 mg/L PMSF，100 mg/L抑肽酶)的比例充分裂解细胞，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，保留上清，-80 ℃贮存备用，以BCA法测定总蛋白浓度。SDS-PAGE采用5%浓缩胶，8%分离胶，上样量为100 μg，电压90 V恒压18 min跑到浓缩分离交界处，更改电压为120 V，继续电泳55 min。电泳结束后取出凝胶转移至同等大小的硝酸纤维素膜上。转移后的硝酸纤维素膜置于封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST溶液)4 ℃过夜，加入兔抗Oct3/4多克隆抗体(1∶100)，室温处理2 h，TBST漂洗10min×3次；辣根过氧化物酶联抗兔IgG(1∶5 000)，室温处理2 h，PBST漂洗10 min×3次；ECL显色液中反应至条带清晰。

3.6RT-PCR 采用RNeasy Mini试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。参照Qiagen® OneStep RT-PCR试剂盒实验操作说明进行RT-PCR，总反应体系50.0 μL，其中5×Qiagen OneStep RT-PCR 缓冲液10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5×Q-Solution 10.0 μL，RNase 抑制剂10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。扩增条件为：50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 5 min。然后，取RT-PCR产物10.0 μL，加上样缓冲液2.0 μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，80 V 30 min，凝胶图像成像系统拍摄保存实验结果，凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer 3.0)分析各目的基因与β-actin基因条带灰度值，计算出相对表达量。

4统计学处理

结 果

1Oct3/4慢病毒载体的构建及滴度测定

将Oct3/4重组质粒进行阳性克隆的PCR鉴定，PCR产物1 266 bp，见图1。选取阳性克隆测序，测序结果与Oct3/4序列完全一致。证明大鼠Oct3/4慢病毒载体构建成功，见图2。将收集的慢病毒液以10倍梯度稀释后，分别感染293T 细胞，计算出慢病毒的最终滴度为2×1011TU/L。

2Oct3/4慢病毒感染MSCs

感染24 h后，感染组MSCs部分细胞收缩呈圆形、梭形，少数细胞脱落、死亡。倒置荧光显微镜下观察，感染组中在细胞核可以观察到部分绿色荧光；而阴性对照组可见绿色荧光分布在细胞质中。感染48 h时，转染成功的细胞，立体感增强，细胞数量有所增加，GFP表达最理想。其中MOI值为10，感染48 h时感染率最高，荧光表达最强，感染率可达83.4%±2.2%，阴性对照组和感染组GFP感染率没有明显差异，但是细胞形态变化没有感染组显著，见图3、表2。

Figure 1. PCR results for constructedOct3/4 vector. A：ddH2O; B：empty vector; C：GAPDH; D：marker; F： nothing; E,G-I：transformant ofOct3/4.

图1Oct3/4慢病毒载体构建PCR结果

Figure 2.Oct3/4 lentiviral vector.

图2Oct3/4慢病毒载体构建

MTT结果提示，感染前各组MSCs的细胞活性无统计学意义(P>0.05)；感染24 h，感染组细胞活性显著下降，与各对照组比较均有统计学意义(P<0.05)，各对照组之间无统计学意义。感染48 h、72 h、96 h后细胞活性值虽较24 h有所上升(P<0.05)，但与其它组比较仍有统计学意义(P<0.05)，见表3。

Figure 3. The cell infection rate (48 h after transfection, ×200). A: transfection group; B: positive control group.

图3慢病毒感染4d的细胞感染率

表2 细胞感染效率

表3 各组MSCs细胞活性

*P<0.05vsother groups.

3β-巯基乙醇体外诱导MSCs分化为神经元

3.1形态学观察 未感染组MSCs诱导后细胞形态结构变化较慢。诱导5 h，少量细胞出现神经元改变，胞体收缩呈多角形或圆形，突起细长，有数个分支，部分在局部形成网络。多数细胞仍未发生变化，呈扁平样，无突起。感染Oct3/4慢病毒组诱导后，细胞形态变化更为明显，诱导5 h多数细胞胞体收缩呈圆形、锥形，细胞突起细长，交织成网，立体感较强，形成较典型的神经元结构，少量细胞脱落、死亡。阴性对照组类似于未感染组，见图4。

3.2免疫细胞化学染色法 未感染组诱导5 h，神经元标记物NSE和MAP-2有少量表达。阴性对照组与未感染组类似。感染组诱导5 h，NSE和MAP-2的表达均显著高于其它各组(P<0.05)。各组GFAP表达率均小于1%，无显著差异，见图5、6及表4。

Figure 4. β-mercaptoethanol induced MSCs into neurons(×200). A,B:transfection group; C,D: negative control group; E,F: non-transfection group.

图4β-巯基乙醇诱导各组MSCs向神经元分化

Figure 5. β-mercaptoethanol induced MSCs into neurons and expression of MAP-2 5 h after induction (×200). A: transfection group; B: negative control group; C: non-transfection group.

图5β-巯基乙醇诱导各组MSCs向神经元分化和MAP-2的表达

Figure 6. β-mercaptoethanol induced MSCs into neurons and expression of NSE 5 h after induction (×200). A: transfection group; B: negative control group; C: non-transfection group.

图6β-巯基乙醇诱导各组MSCs向神经元分化和NSE的表达

表4β-巯基乙醇诱导5h各组细胞免疫化学染色结果

GroupNSEMAP-2GFAPNon-transfection64.2±2.362.8±2.6<1Transfection84.1±1.7*83.5±1.3*<1Negativecontrol63.8±1.461.7±2.2<1

*P<0.05vsother groups.

图7MAP-2蛋白的表达

3.3Western blotting结果 各组分别诱导分化5 h，均可见MAP-2表达，MAP-2蛋白量为74 kD。并且未转染组和阴性对照组无明显差异，感染组MAP-2的表达较前2组显著增高，见图7。

3.4RT-PCR结果 各组分别诱导分化5 h，MAP-2 mRNA均有表达，扩增产物为710 bp。未转染组和阴性对照组无明显统计学差异，感染组MAP-2的表达较前2组显著增高，见图8。

图8MAP-2mRNA的表达

4Oct3/4的表达变化

4.1免疫细胞化学染色结果 诱导前，未感染组细胞核中有部分Oct3/4表达。阴性对照组与未感染组无明显差异。感染组细胞核中Oct3/4表达明显增强，与其它各组相比有显著差异(P<0.01)。诱导分化5 h后，各组细胞中Oct3/4表达显著减少(P<0.05)，但感染组Oct3/4表达仍显著高于其它2组(P<0.01)，见图9、表5。

Figure 9. β- mercaptoethanol induced MSCs into neurons and expression of Oct3/4 5 h after induction (Cy3 and DAPI straining, ×200). A,B:transfection group before induction; C-F:transfection group 5 h after induction; G,H: negative control group before induction; I-L: negative control group 5 h after induction.

图9β-巯基乙醇诱导各组MSCs向神经元分化和Oct3/4的表达

表5β-巯基乙醇诱导5h各组细胞Oct3/4免疫化学染色结果

GroupBeforeinduction5hafterinductionNon-transfec-tion44.1±2.529.3±2.4Transfection76.7±1.9**59.6±1.6**Negativecontrol43.4±1.327.8±2.7

**P<0.01vsother groups.

4.2Western blotting结果 诱导前，各组均有Oct3/4表达，Oct3/4蛋白分子量为46 kD。其中，感染组Oct3/4蛋白表达明显高于其它各组(P<0.05)，阴性对照组与未感染组相比无明显差异。诱导分化5 h后，各组Oct3/4蛋白量表达较诱导前均显著减少(P<0.05)，阴性对照组与未感染组相类似，无显著差异，感染组Oct3/4蛋白量表达仍显著高于其它2组(P<0.05)，见图10。

图10Oct3/4Westernblotting结果

4.3RT-PCR结果 诱导前，各组均有Oct3/4 mRNA表达，其扩增产物为201 bp。其中，感染组Oct3/4 mRNA表达明显高于其它各组，与其它各组相比有显著差异(P<0.05)，阴性对照组与未感染组类似，无显著差异。诱导分化5 h后，各组Oct3/4 mRNA表达较诱导前均显著减少(P<0.05)，阴性对照组与未感染组无显著差异，感染组Oct3/4 mRNA表达仍显著高于其它2组(P<0.05)，见图11。

图11Oct3/4RT-PCR结果

讨 论

慢病毒载体是近年来广泛应用于基因治疗等领域的一种新的基因转移技术[5-6]，本研究成功构建了含有Oct3/4基因的慢病毒载体，通过PCR筛选阳性克隆测序结果表明，为研究Oct3/4在MSCs诱导分化为神经元中的作用提供了较理想的实验工具。感染Oct3/4慢病毒载体的MSCs与其余各组相比在形态上发生了明显变化，根据我们的研究结果推测，感染Oct3/4慢病毒载体可能在一定程度提高了部分细胞的全能性，这与Kim 等[7]研究结果相一致。

Oct3/4在维持胚胎干细胞全能性中起着重要作用，被认为是保持细胞全能性的至关重要的因子[1]，但Oct3/4不仅存在于胚胎干细胞中，在胎儿及成人不同组织的干细胞和祖细胞中[8]，甚至在分化程度较低的神经干细胞中也均有表达[9]。Oct3/4不同的表达水平可以引起胚胎干细胞向不同胚层的分化，特别是在向神经外胚层分化的过程中，Oct3/4的表达明显减少[10]。

Rodda等[11]研究发现Oct3/4在胚胎干细胞中处于调节细胞全能性的顶层位置，Oct3/4与Sox2、Nanog通过参与LIF-STAT、BMP、Wnt等信号转导通路[12-13]，对胚胎干细胞中的管家基因进行调控，从而保持胚胎干细胞的全能性。其中以LIF-STAT信号通路最为重要。在此通路中，Oct3/4与Nanog通过对STAT3表达的调节，进而调控JAK-STAT3信号转导实现对细胞增殖分化的调节[14]。Hao等[15]研究发现在MSCs向神经元定向分化的过程中，通过抑制JAK -STAT3信号通路，可以减少向星形胶质细胞分化的比例，提高神经元分化比例。此外，Oct3/4还与Zfp143、Zfp206、Zfp521等多种锌指蛋白相互作用，在维持胚胎干细胞的多潜能性及向神经元分化的过程中起到了重要的调节作用。其中Zfp521更是在脑神经形成过程中发挥决定性作用[16]，我们将另文报道Zfp521与Oct3/4在大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元中的作用。

本研究发现，MSCs感染Oct3/4慢病毒后，Oct3/4表达量显著增加，通过β-巯基乙醇诱导后，MSCs向神经元分化效率显著提高，神经元早中期标志物NSE和成熟神经元特异性标志物MAP-2表达均明显增高，且未见GFAP表达；增加Oct3/4的表达，可以促进MSCs向神经元分化。而且在诱导前后，通过免疫细胞化学法、Western blotting和RT-PCR法证明，Oct3/4随着诱导分化的进行，表达量也随之减少。这些结果提示Oct3/4可能在MSCs分化神经元中起较重要的作用，但是具体机制尚不明确，可能与前述作用有关。

本研究MTT结果发现感染组细胞存活率显著降低，这可能因为Oct3/4作为维持细胞全能性相关的重要转录因子和调控因子,其过表达影响了细胞的正常生长。

综上所述，本研究发现Oct3/4在MSCs向神经元诱导分化过程中，表达量随着诱导分化的进行而减少；而且采用慢病毒载体建立Oct3/4过表达的MSCs神经分化效率提高，提示Oct3/4在大鼠MSCs诱导分化为神经元过程中可能起到了重要的调控作用。

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RoleofOct3/4indifferentiationofratbonemarrowmesenchymalstemcellsintoneurons

WANG Shu-yang, HAN Rui, ZHANG Guang-yu, WANG Cui-qin, PENG Yue, LU Jing-jing, PENG Tao, JIA Yan-jie

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail:jiayanjie1971@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the role of Oct3/4 in inducing differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into neuronsinvitro.METHODSLentivirus (LV) vector containingOct3/4 gene was constructed and transfected into rat bone marrow MSCs. The MSCs were divided into non-transfection group, transfection group (transfected withOct3/4-LV) and negative control group (transfected with FU-PCG-NC-LV). β-mercaptoethanol (β-ME) was used to induce differentiation of MSCs into neurons. Morphological changes and the fluorescence in transfected MSCs were observed under inverted fluorescence microscope. The expression of Oct3/4 and microtubulin-associated protein 2(MAP-2) at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and Western blotting. The expression of Oct3/4 and the neural cell specific markers neuron-specific enolase(NSE), MAP-2 and glial fibrillary acidic protein(GFAP) were determined by immunocytochemical method. The viability of the MSCs was analyzed by MTT assay.RESULTSThe results of PCR confirmed that theOct3/4-LV was successfully constructed and the virus titer was 2×1011TU/L. The best transfection efficiency and survival rate appeared when multiply of infection(MOI) was 10 and at 48 h, and the fluorescence of MSCs was mostly displayed. The efficiency of transfection was up to 83.4%±2.2%. The shape of the MSCs was changed in transfection group, and the survival rate of the MSCs in transfection group was significant lower than that in other groups (P<0.05). MSCs were induced by β-ME to differentiate into neurons and the best efficiency of induction was observed in transfection group. The typical neuronal morphology was observed in transfection group after induction and the expression levels of NSE and MAP-2 were higher than those in other groups (P<0.05). Compared with other groups, the expression of Oct3/4 in transfection group was significantly increased (P<0.01). Furthermore, the expression of Oct3/4 was time-dependently decreased and there was significant difference between before induction and 5 h after induction (P<0.05).CONCLUSIONOct3/4 may have an important role in regulating the differentiation of rat MSCs into neurons．

Oct3/4; Bone marrow mesenchymal stem cells; Neurons; Lentivirus

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.001