大鼠急性坏死性胰腺炎和慢性胰腺炎代谢特征分析

潘春树 马超 田冰 汪剑 杨根金 陆建平

·论著·

大鼠急性坏死性胰腺炎和慢性胰腺炎代谢特征分析

潘春树 马超 田冰 汪剑 杨根金 陆建平

目的用代谢组学方法研究大鼠胰腺组织代谢特征，以期发现胰腺炎症的标记性代谢物。方法Wistar大鼠22只，按数字表法随机分成急性坏死性胰腺炎组(ANP，7只)、慢性胰腺炎组(CP，6只)和对照组(9只)。ANP组经腹腔注射20% L-精氨酸溶液制模；CP组经尾静脉注射二丁基二氯基锡(DBTC)溶液制模；对照组注射等量生理盐水。检测血清淀粉酶含量，胰腺组织行病理学检查。利用高分辨魔角旋转核磁共振波谱对离体胰腺组织进行代谢成分分析，并对实验数据进行主成分分析，比较ANP与CP的代谢特征。结果与对照组相比，ANP组小分子代谢物亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸含量增加，而CP组这些代谢物含量减少。ANP组和CP组的磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱、胆碱含量均升高，脂肪酸、乳酸、甜菜碱、甘氨酸含量均下降，CP组中脂类代谢产物含量明显高于ANP组，且仅在CP组中观察到牛磺酸含量升高。结论胰腺炎症疾病造成胰腺组织内代谢异常，升高的牛磺酸水平可能是区分CP和ANP的标记物。

胰腺炎，急性坏死性； 慢性胰腺炎； 高分辨魔角旋转核磁共振； 主成分分析

胰腺作为人体第二大器官，其代谢异常总是先于组织结构和功能的改变，探究胰腺组织代谢产物对进一步了解其发病机制和早期诊断胰腺疾病将起到重要作用。本研究利用高分辨魔角旋转核磁共振波谱技术(high-resolution proton magic angle spinning nuclear magnetic resonance,1H MAS NMR)[1]分析急性坏死性胰腺炎(ANP)和慢性胰腺炎(CP)大鼠胰腺的代谢特征。

材料和方法

一、实验动物及分组

雄性Wistar大鼠22只，体重200～220 g，由第二军医大学动物实验中心提供。按数字表法随机分成ANP组(7只)、CP组(6只)和对照组(9只)。CP组经尾静脉注射DBTC(Sigma公司 8 mg/kg体重)[2]，2个月后处死。ANP组腹腔注射20% L-精氨酸溶液2.5 mg/kg体重，间隔1 h，重复注射[3]，12 h后处死。对照组注射等量生理盐水。收集血样本与胰腺组织。

二、病理学检查及血清淀粉酶检测

部分胰腺组织常规病理检查，由2名资深病理学专家阅片，并从胰腺水肿、出血、坏死、炎细胞浸润等方面进行评价。血样本离心分离血清，上Hitachi 7600-120全自动生化分析仪测定血清淀粉酶含量。

三、1H MAS NMR分析

切取液氮保存的新鲜胰腺组织约15 mg，装入直径4 mm的附带球形内腔的Zr02转子中，并加入适量氘水用于锁场和排除空气。实验在BRUKER AVANCE Ⅱ 600 NMR谱仪上完成。1H共振频率为600.13 MHz，测试所用探头为4 mm双共振(1H/13C)MAS探头，魔角旋转速率为5 kHz，实验温度为300.0k(≈27℃)。谱图采样点数64 k，谱宽15 kHz，弛豫延迟2 s，累加次数160次。均采用预饱和法压制水峰，并利用自旋回波脉冲(Carr-Purcell-Meiboon-Gill,CPMG)序列压制大分子及其他一些短T2物质的信号，自旋-自旋弛豫总时间为180 ms。同时，还对各组胰腺样本进行2D NMR实验，包括1H-1H 相关波谱(COSY)和1H-1H总相关波谱(TOCSY)实验，并结合文献对胰腺组织的NMR特征峰进行指认[4]。

利用Bruker公司的Topspin 3.1软件对NMR实验数据进行相位、基线校正。利用AMIX软件(版本3.9.5)对简化后的数据组进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，即图谱进行简化降维处理，得到相应的得分图(scores)和负载图(loadings)。

结 果

一、血清淀粉酶水平

ANP组血清淀粉酶水平为(3527±429)U/L，明显高于CP组的(2926±302)U/L和对照组的(2820±169)U/L。

二、胰腺病理改变

CP组见胰腺小叶结构破坏，腺泡消失，炎性细胞广泛浸润，纤维组织大量增生，广泛间质纤维化。ANP组见胰腺水肿、出血及黄白钙化点，腺泡结构破坏，大片组织坏死，大量炎性细胞浸润。对照组胰腺组织未见明显病理改变(图1)。

图1对照组(a)、ANP组(b)及CP组(c)胰腺病理改变(HE ×200)

三、1H MAS NMR分析结果

对照组、ANP组及CP组具有代表性1H MAS NMR波谱见图2。与对照组相比，ANP组亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ileu)、缬氨酸(Val)峰信号明显增加，CP组则明显降低。牛磺酸(Tau)峰信号仅在CP组观察到。此外，ANP组和CP组中均可见甘油磷酸胆碱+磷酸胆碱(GPC/PC)和胆碱(Cho)峰增加，乳酸(Lac)、甜菜碱(Bet)、甘氨酸(Gly)峰降低。

图2对照组(a)、ANP组(b)及CP组(c)1H MAS NMR谱图

对CPMG谱中δ0.50-9.00 ppm化学位移范围数据进行PCA，得到得分图和相应的负载图(图3a，b)。在得分图中各组表现出组间相似性，在PC1方向上，CP组距离与对照组很近，但远离ANP组。由负载图可知脂质代谢物(δ0.95-0.85 ppm, δ1.40-1.25 ppm,δ2.10-2.00 ppm,δ5.35-5.30 ppm)、Lac(δ1.40-1.35 ppm)、GPC/PC(δ3.25-3.2 ppm)对得分图中3组的区分起了很大的作用。为消除脂类化合物的影响，再对δ2.90-9.00 ppm化学位移范围内的谱图进行PCA分析，得到得分图和负载图(图3c，d)。得分图在PC1方向上，CP组紧挨ANP组，但远离对照组。负载图得出Gly(δ4.35-4.25 ppm)、Lac(δ4.15-4.05 ppm)、Cho(δ3.60-3.55 ppm)、Bet(δ3.30-3.25 ppm)、Tau(δ3.45-3.40 ppm)和GPC/PC(δ3.75-3.65 ppm,δ3.25-3.2 ppm)，对得分图中3组区分起的作用很大。

图3由1H NMR CPMG谱图PCA分析得到的得分图及负载图(a、b为δ0.50-9.00 ppm分析结果；c、d为δ2.90-9.00 ppm分析结果；▲为对照组，■为ANP组，●为CP组)

讨 论

本实验结果显示，Gly、Lac、Bet、Cho、GPC/PC、Leu/Ileu/Val及FA在胰腺中的代谢与ANP和CP存在着相互联系。相对于CP组，ANP组中可见Leu/Ileu/Val含量增加，Tau和FA含量降低。

Tau是一种细胞内自由氨基酸，来源于食物摄取和体内合成两种途径。它参与血清胆固醇、血糖和细胞内钙水平的调节[5]。仅CP组观察到Tau信号增强，可能是潜在区分CP与ANP的标志物。Gly是一种抑制性神经传导因子和抗氧化剂；乳酸盐是无氧酵解产物，可在缺血、缺氧时升高；Bet是体内重要的甲基供体，可为同型半胱氨酸转化为蛋氨酸和二甲基甘氨酸提供甲基。这些氨基酸对维持肝脏和胰腺正常功能、细胞复制及解毒功能起支持作用。本结果显示，CP和ANP组Gly、Lac、Bet含量均较对照组下降，表明CP和ANP时需要消耗这些代谢产物来为胰腺解毒。

胰腺内脂质含量通常与诸多因素有关，例如：遗传、年龄、性别、习惯等[6]。CP组的脂质水平与对照组相比稍微下降，而ANP组的脂质水平则较对照组明显下降。CP较ANP具有更丰富的脂质代谢，反映了胰腺炎症过程中两者之间代谢的区别。

胆碱类代谢物信号是由Cho、GPC及PC峰叠加而成[7]。胆碱类代谢产物常作为标记物，其含量的增加是肿瘤细胞快速增殖的结果[8]。虽然胰腺炎症不会引起细胞的快速增殖，但本结果显示ANP和CP组存在较高的总胆碱水平。这是由于胆碱激酶和磷酸肌酸转移酶的阻滞或者经胞苷二磷胆碱(CDP-Cho)代谢途径的磷酸肌酸大量消耗所致。因此，胆碱类代谢物也可能是CP和ANP炎症过程中有特点的代谢产物。

[1] 何新红，陆建平，方芳，等.大鼠慢性胰腺炎离体组织块高分辨氢质子磁共振波谱分析.中华胰腺病杂志，2008，8:393-396.

[2] Merkord J, Weber H, Sparmann G, et al. The course of pancreatic fibrosis induced by dibutyltin dichloride (DBTC). Ann N Y Acad Sci,1999,880:231-237.

[3] Dabrowska A,Jacewicz D,Lapińska A,et al.Pivotal participation of nitrogen dioxide in L-arginine induced acute necrotizing pancreatitis:protective role of superoxide scavenger 4-OH-TEMPO.Biochem Biophys Res Commun,2005,326:313-320.

[4] Griffin JL, Mann CJ, Scottc J, et al. Choline containing metabolites during cell transfection: an insight into magnetic resonance spectroscopy detectable changes. FEBS Lett, 2001, 509:263-266.

[5] E1-Sayed S, Bezabeh T, Odlum O, et al. An ex vivo study exploring the diagnostic potential of 1H magnetic resonance spectroscopy in squamous cell carcinoma of the head and neck region. Head Neck, 2002,24: 766-772.

[6] Zyromski NJ, Mathur A, Gowda GA, et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy-based metabolomics of the fatty pancreas: implicating fat in pancreatic pathology. Pancreatology,2009,9:410-419.

[7] Braganza JM, Lee SH, McCloy RF, et al. Chronic pancreatitis. Lancet,2011,377:1184-1197.

[8] Zhang H, Wang Y, Gu X, et al. Metabolomic profiling of human plasma in pancreatic cancer using pressurized capillary electrochromatography. Electrophoresis,2011,32:340-347.

Metabolicfeaturesofacutenecrotizingpancreatitisandchronicpancreatitis

PANChun-shu,MAChao,TIANBing,WANGJian,YANGGen-jin,LUJian-ping.
DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

YANGGen-jin,Email：gjinyang@hotmail.com；LUJian-ping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

ObjectiveTo study the metabolite features of acute necrotizing pancreatitis (ANP) and chronic pancreatitis (CP) in rats.MethodsA total of 22 Wistar rats were divided into ANP group (n=7), CP group (n=6) and the control group (n=9). ANP model was induced peritoneous injection of 20% L-arginine, and the rats were sacrificed 12 hours later. CP model was induced by intravenously injection of DBTC (8 mg/kg body weight), and the rats were sacrificed after 2 months. The rats in the control group

same amount of saline. Serum amylase was determined and pancreatic tissues were pathologically examined. Metabolic changes of pancreatic tissues in vitro were studied by high resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance (MAS NMR), and analyzed by using principal components analysis (PCA). Characteristic metabolites of ANP and CP were compared.ResultsCompared with the control group, increased leucine, iso-leucine and valine levels were observed in ANP group, however, the opposite trends were observed in CP group. Phosphocholine, glycerophosphocholine, choline levels were increased and fatty acids, lactate, betaine, glycine levels were decreased in both ANP and CP groups. The lipid content in CP group were significantly higher than that in ANP group and the increased taurine was only observed in CP group.ConclusionsThere were obvious metabolic features in pancreatic tissue in rats with pancreatitis disorders, and the increased taurine could be used as biomarker to discriminate ANP and CP.

Pancreatitis, acute necrotizing； Chronic pancreatitis； Magic angle spinning nuclear magnetic resonance； Principal components analysis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.016

国家自然科学基金(30870709)

200433 上海，第二军医大学长海医院放射科(潘春树、马超、田冰、汪剑、陆建平)，药学院分析测试中心(杨根金)

杨根金，Email：gjinyang@hotmail.com；陆建平，Email：cjr.lujianping@vip.163.com

2011-07-20)

(本文编辑：屠振兴)