大承气汤对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺水通道蛋白1的影响

陈亚峰 奉典旭 陈腾 田继云 谢金昆 施浩然 张静喆 韩峰

·论著·

大承气汤对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺水通道蛋白1的影响

陈亚峰 奉典旭 陈腾 田继云 谢金昆 施浩然 张静喆 韩峰

目的观察急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺组织水通道蛋白1(AQP1)的表达以及大承气汤对其的影响。方法160只雄性SD大鼠按随机数字法分为对照组、ANP组、地塞米松组、乙酰唑胺组及大承气汤组，每组32只。采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠方法制备ANP模型。地塞米松组于造模后即刻静脉给予地塞米松4 mg/kg体重；乙酰唑胺组于造模前2 h用含乙酰唑胺的生理盐水1 ml灌胃；大承气汤组于造模前48、24、2 h分别用大承气汤2 ml/次灌胃；对照组仅开腹触摸胰腺数次后关腹。制模后3、6、12、18 h分批处死8只大鼠。记录腹水量；检测血清淀粉酶；胰腺组织病理检查及电镜观察；伊文思兰(EB)血管外渗法检测毛细血管通透性；实时PCR和蛋白质印迹法检测AQP1 mRNA和蛋白表达。结果ANP组血清淀粉酶水平显著升高，胰腺损伤明显；地塞米松组和大承气汤组淀粉酶水平较ANP组降低，胰腺损伤减轻；乙酰唑胺组淀粉酶水平高于ANP组，胰腺病理损伤较ANP组加重。造模后6 h，对照组、ANP组、地塞米松组、乙酰唑胺组、大承气汤组胰腺组织EB含量分别为(13.44±2.56)、(126.35±14.80)、(86.31±14.46)、(108.99±15.07)、(78.29±16.85)mg/L；AQP1 mRNA表达量为(170.07±22.48)%、(83.93±8.98)%、(117.09±10.70)%、(69.00±8.98)%、(112.82±11.79)%；AQP1蛋白表达量为0.23±0.06、0.10±0.02、0.32±0.03、0.13±0.02、0.45±0.04。ANP组的EB量显著高于对照组，而AQP1 mRNA及蛋白的表达显著低于对照组(P值均<0.05)；地塞米松组及大承气汤组EB含量显著低于ANP组，而AQP1 mRNA及蛋白的表达显著高于ANP组(P值均<0.05)。结论AQP1在ANP大鼠胰腺组织毛细血管渗漏的发生中起重要作用。大承气汤通过调控AQP1的表达可减轻ANP大鼠的胰腺损伤。

急性胰腺炎，坏死性； 大承气汤； 水通道蛋白1； 毛细血管内皮屏障

毛细血管内皮屏障功能损害是重症急性胰腺炎(SAP)发病早期重要的病理生理变化[1]。目前研究表明，经内皮细胞介导的水转运障碍是SAP时毛细血管通透性升高的重要环节。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一组构成水通道并与水通透有关的细胞膜转运蛋白，其中水通道蛋白1(AQP1)广泛分布于机体的毛细血管内皮，选择性介导细胞膜内外水的转运。糖皮质激素可上调AQP1表达[2-3]，而乙酰唑胺则可抑制其表达[4]。大承气汤在临床上用于治疗急性胰腺炎，疗效显著。本研究观察大承气汤对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺AQP1表达及毛细血管内皮屏障功能的影响。

材料与方法

一、动物模型制备

清洁级雄性SD大鼠160只，体重(220±30)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证为SCXK(沪)2003-0002。按数字表法随机分为对照组、ANP组、地塞米松组、乙酰唑胺组及大承气汤组，各32只。采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)1.5 ml/kg体重的方法制备ANP模型。地塞米松组于造模后即刻经阴茎静脉给予地塞米松4 mg/kg体重[5]；乙酰唑胺组于造模前2 h给予乙酰唑胺56 mg/kg体重[6](生理盐水稀释)灌胃；大承气汤组于制模前48、24、2 h分别用大承气汤(大黄12 g、厚朴24 g、枳实12 g、芒硝6 g)[7]2 ml灌胃[8]。造模后3、6、12、18 h分批处死8只大鼠。处死前1 h经阴茎静脉注入2%伊文思兰(EB，Sigma公司)1 ml/kg体重。记录腹水量；抽取血样本；取胰腺组织，部分置2.5%戊二醛溶液中固定，部分甲醛固定，部分液氮冻存。

二、检测项目及方法

1．血清淀粉酶测定：采用酶法在全自动生化分析仪上测定。

2．胰腺组织病理学检查：由病理科医师盲法阅片，并根据Schmidt标准[9]进行病理学评分。

3．毛细血管通透性测定：取胰腺组织300 mg，加入1 ml甲酰胺溶液，60℃孵育24 h。2000 r/m离心30 min，取上清液。采用紫外分光光度计法测定620 nm处吸光值(A)，以空白管调零。根据已知EB浓度绘制标准曲线。根据所测组织的A620值计算组织中EB含量。

4．胰腺组织超微结构检查：取2.5%戊二醛固定的胰腺组织，经1%锇酸后固定、脱水、渗透包埋、切片、电子染色，于透射电镜下观察超微结构变化。

5．AQP1 mRNA表达检测：取冻存的胰腺组织，Trizol(Invitrogen公司)法抽提总RNA。先逆转录为cDNA，再行实时荧光定量PCR。AQP1正义序列5′-CTCCGGGCTGTCATGTATATCA-3′，反义序列5′-ATGGCGGAGGCAACGA-3′，探针5′-CGCCCAGTG-TGTGGGAGCC-3′；内参DAPDH正义序列5′-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3′，反义序列5′-GCTGTT-GAAGTCACAGGAGACAA-3′， 探针5′-CATCCTGGG-CTACACTGAGGACCA-3′。PCR反应条件： 95℃ 2 min，95℃ 30 s、58℃ 30 s，40次循环。每个样本测2次。应用仪器自带软件获取Ct值。mRNA相对定量通过2-△Ct×100%计算，△Ct值= Ct值AQP1-Ct值GAPDH。

6．AQP1蛋白检测：冻存的胰腺组织经裂解后制成匀浆，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后常规行蛋白质印迹法，以β-actin作为内参。用ImageJ(1.33h, National Institutes of Health)分析软件获取条带的灰度值，以AQP1与β-actin的灰度比值表示蛋白相对表达量。

三、统计学处理

结 果

一、腹水量

对照组大鼠无腹水形成；ANP组可见淡黄色或红色血性腹水，制模后12 h腹水量最多；乙酰唑胺组腹水量较ANP组多；地塞米松组及大承气汤组腹水量明显少于ANP组(P<0.01，表1)。

二、胰腺组织病理学改变

对照组胰腺未见明显异常；ANP组胰腺水肿、出血、坏死，有炎性细胞浸润；乙酰唑胺组胰腺组织病理改变较ANP组稍有加重，但差异无统计学意义；地塞米松组及大承气汤组胰腺组织病变较ANP组明显减轻(P<0.05，表1，图1)。

三、血清淀粉酶水平

ANP组血清淀粉酶水平显著高于对照组；地塞米松组及大承气汤组各时间点淀粉酶水平均低于同时点ANP组(P值均<0.05)；乙酰唑胺组血清淀粉酶水平较ANP组高，但差异并无统计学意义(表2)。

四、胰腺组织毛细血管超微结构改变

对照组胰腺组织毛细血管结构完整，管壁连接完整，内容物清晰，红细胞形状规整，管周组织正常，细胞内细胞器完整；ANP组毛细血管管壁变薄，内皮细胞间连接复合体被破坏，管内红细胞大量聚集，结构不完整；乙酰唑胺组毛细血管结构破坏较ANP组严重；地塞米松组及大承气汤组较ANP组减轻(图2)。

五、胰腺组织毛细血管通透性改变

ANP组胰腺组织毛细血管通透性从3 h起较对照组显著增加；乙酰唑胺组仅3 h点的毛细血管通透性较ANP组显著增加；地塞米松组及大承气汤组从6 h起血管通透性均较ANP组显著降低(P值均<0.05，表3)。

六、胰腺组织AQP1 mRNA和蛋白表达

ANP组大鼠胰腺组织AQP1 mRNA和蛋白表达从3 h起明显低于对照组；乙酰唑胺组的表达显著低于ANP组；地塞米松组及大承气汤组的表达显著高于ANP组(P值均<0.05，表4，图3)。

表1 各组大鼠腹水量、胰腺病理评分的变化

注：a指各组每个时点的只数；与ANP组比较，bP<0.05

图1 对照组(a)、ANP组(b)、乙酰唑胺组(c)、地塞米松组(d)、大承气汤组(e)的胰腺病理改变(HE ×200)

表2 各组大鼠血清淀粉酶水平的变化

注：a指各组每个时点的只数；与对照组比较，bP<0.05；与ANP组比较，cP<0.05

图2 对照组(a)、ANP组(b)、乙酰唑胺组(c)、地塞米松组(d)、大承气汤组(e)胰腺毛细血管的超微结构变化( ×8200)

表3 各组胰腺组织毛细血管通透性比较

注：a指各组每个时点的只数；与对照组比较，bP<0.05；与ANP组比较，cP<0.05

表4 各组胰腺组织AQP1 mRNA和蛋白表达的变化

注：a指各组每个时点的只数；与对照组比较，bP<0.05；与ANP组比较，cP<0.05

图3对照组(1)、ANP组(2)、乙酰唑胺组(3)、地塞米松组(4)、大承气汤组(5)胰腺组织AQP1蛋白表达

讨 论

毛细血管内皮屏障功能损害是SAP发病的关键环节。多种因素损伤毛细血管内皮，引起血管通透性升高，局部的炎症介质通过高通透性的微血管进入血液，造成全身性炎症反应，同时血管内液外渗到组织间隙，造成广泛的水肿及血液循环障碍，进一步加重病情。水通道蛋白AQP1参与急性胰腺炎的发病过程。Ohta等[10]研究发现，AQP1敲除小鼠对雨蛙素诱导的水肿性胰腺炎易感性升高。Ko等[11]研究也发现，自身免疫性胰腺炎患者的胰管质膜的AQP1表达上调。高振明等[12]研究表明，AQP1参与急性胰腺炎相关肺损伤的形成。

本实验结果显示，造模后3 h起，ANP组血清淀粉酶显著升高，出现明显的腹水，胰腺组织EB含量显著增加，AQP1 mRNA和蛋白的表达显著下降，表明在ANP大鼠模型早期，由于AQP1表达下降引起胰腺组织的毛细血管通透性显著升高。

地塞米松可上调AQP1表达，而乙酰唑胺下调其表达。本实验分别用地塞米松和乙酰唑胺干预ANP大鼠，结果显示，地塞米松组大鼠胰腺AQP1基因表达增加，胰腺病理损伤减轻，胰腺毛细血管通透性降低，而乙酰唑胺组的表现与其相反，进一步证实AQP1基因参与毛细血管通透性的调控。本实验又应用大承气汤干预ANP大鼠，结果显示，大承气汤与地塞米松干预的效果一致。它们在调控AQP 1基因表达、减轻胰腺病理损伤、降低胰腺组织毛细血管通透性等方面的效应无显著差异，而在减少腹水量及降低血清淀粉酶水平方面，大承气汤较地塞米松更显著。

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[12] 高振明,陈海龙,刘小东.急性胰腺炎大鼠肺组织中水通道蛋白-1的表达及功能. 世界华人消化杂志,2007,15:453-457.

EffectofDachengqidecoctiononpancreasaquaporin1inratswithacutenecrotizingpancreatitis

CHENYa-feng,FENGDian-xu,CHENTeng,TIANJi-yun,XIEJin-kun,SHIHao-ran,ZHANGJing-zhe,HANFeng.
DepartmentofGeneralSurgery,PutuoHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062,China

FENGDian-xu,Email:fdianxu@sohu.com

ObjectiveTo detect the expression of aquaporin 1 in pancreas of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and to study the effect of Dachengqi decoction on it.MethodsOne hundred and sixty male SD rats were randomly divided into control group (C group,n=32), ANP group (n=32), Dexamethasone group (De group,n=32), Acetazolamide group (A group,n=32) and Dachengqi decoction group (DD group,n=32). ANP model was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct. Rats in De group

dexamethasone (4 mg/kg) intravenously after ANP induction； while rats in A group received 1 ml acetazolamide via gastric lavage 2 h before ANP induction； rats in DD group received 2 ml Dachengqi decoction via gastric lavage 48, 24, 2h before ANP induction；rats in C group received laparotomy. Eight rats in each group were sacrificed at 3 h, 6 h, 12 h and 18h after induction of ANP models. Quantity of ascites and levels of serum amylases were measured. Pathological changes in pancreas tissue were detected by HE and electron microscope. Capillary permeability in pancreas tissue was detected by Evans Blue (EB) extravasations method. AQP1 expression in pancreas tissue was detected by real-time PCR and Western blotting.ResultsLevels of serum amylase in ANP group was significantly higher, and the pancreatic injuries were obvious; the levels of serum amylase in De group and DD group was lower than that in ANP group, and the pancreatic injuries were attenuated. The levels of serum amylase in A group were higher than that in ANP group, and the pancreatic injuries were more severe than that in ANP group. Six hours after ANP induction, the levels of EB in pancreas were (13.44±2.56), (126.35±14.80), (86.31±14.46), (108.99±15.07), (78.29±16.85)mg/L In C group, ANP group, De group, A group and DD group, and the expression of AQP1 mRNA in pancreatic tissue was (170.07±22.48)%, (83.93±8.98)%, (117.09±10.70)%, (69.00±8.98)%, (112.82±11.79)%; and the expression of AQP1 protein was 0.23±0.06, 0.10±0.02, 0.32±0.03, 0.13±0.02, 0.45±0.04. The content of EB in ANP group was higher than that in C group, while the expression of AQP1 mRNA and protein in ANP group was significantly lower than that in C group (P<0.05). The content of EB in De group and DD group was significantly lower than that in ANP group, while the expression of AQP1 mRNA and protein was significantly higher than that in ANP group (P<0.05).ConclusionsAQP1 plays an important role in the pathogenesis of capillary endothelial barrier dysfunction in rats with ANP. Dachengqi Decoction can attenuate pancreatic injuries of rats by regulating the expression of AQP1.

Acute pancreatitis, necrotizing； Dachengqi decoction； Aquaporin 1； Capillary endothelial barrier

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.013

国家自然科学基金(30701136)；上海市青年科技启明星计划(05QMX1450)

200062 上海，上海中医药大学附属普陀医院普外科(陈亚峰、奉典旭、陈腾、田继云、谢金昆、施浩然、韩峰)；上海中医药大学附属龙华医院普外科(张静喆)

奉典旭，Email:fdianxu@sohu.com

2011-05-23)

(本文编辑：吕芳萍)