外源性PTEN对胰腺癌细胞ASPC-1增殖、侵袭及转移的影响

李宏宇 李建军 刘旭 吴春燕 赵佳钧 陈延志 郭晓钟

·论著·

外源性PTEN对胰腺癌细胞ASPC-1增殖、侵袭及转移的影响

李宏宇 李建军 刘旭 吴春燕 赵佳钧 陈延志 郭晓钟

目的研究第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)对胰腺癌细胞系ASPC-1细胞周期、细胞增殖、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达、裸鼠成瘤及转移能力的影响。方法将含PTEN基因的质粒pE-PTEN转染ASPC-1细胞，以空质粒pE转染为对照，分别获得ASPC-1-pE-PTEN(A-pE-P)细胞及ASPC-1-pE(A-pE)细胞。应用RT-PCR检测细胞PTEN mRNA表达；免疫细胞化学法检测PTEN、VEGF、EGFR蛋白表达；克隆形成实验观察克隆形成数；Transwell小室观察细胞侵袭能力；裸鼠皮下注射癌细胞法观察成瘤情况。结果与ASPC-1细胞比较，A-pE-P细胞的PTEN mRNA表达增加179.3%，PTEN蛋白表达明显增加;VEGF蛋白表达明显减少；EGFR蛋白表达无明显变化；G2/M期细胞数明显增加[(31.5±1.76)%比(26.81±1.03)%，P<0.05]；克隆形成数降低[(24.0±3.9)比(33.3±3.4)，F=4.283，P<0.01]，克隆形成率降低28%；穿膜细胞数明显减少[每高倍视野(46.3±6.6)比(63.8±7.5)个，F=2.476，P<0.05];种植瘤体积明显缩小[(142.4±30.9)比(202.7±43.6)mm3，t=4.834，P<0.01]，抑瘤率达42.4%；远处转移灶明显减少[(2.0±0.7)比(5.0±1.3)个，t=0.451，P<0.01]。结论PTEN基因转染后ASPC-1细胞VEGF表达减少，细胞生长被阻滞在G2/M期，增殖及转移被抑制。

胰腺肿瘤； 基因，肿瘤抑制； 转染； 第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因

第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensinhomology deleted on chromo-some ten, PTEN)位于人10号染色体q23.3区。目前研究认为，PTEN可以通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号转导通路抑制肿瘤细胞增殖，但尚不多见。本研究观察PTEN基因转染胰腺癌细胞系ASPC-1后对细胞血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达，细胞周期、克隆形成，裸鼠种植瘤形成及转移的影响。

材料与方法

一、细胞培养与转染

人胰腺癌细胞系ASPC-1、pEAK8-PTEN及pEAK8质粒由沈阳军区总医院消化内科提供。使用DOTAP脂质体转染试剂盒(保灵曼公司)将pEAK8-PTEN和pEAK8分别转染ASPC-1细胞。应用嘌呤霉素(1 mg/L，Gibco公司)筛选转染细胞30 d，挑选阳性细胞克隆，扩增培养。转染后的细胞分别命名为ASPC-1-pEAK8-PTEN(A-pE-P)和ASPC-1-pEAK8(A-pE)细胞。

二、方法

1．RT-PCR：应用TriPure试剂(Roche公司)提取各组细胞总RNA。应用RT-PCR方法检测细胞PTEN mRNA的表达，试剂盒购自日本Takara公司。序列：PTEN正义5′-CATTATGACACCGCCAAA-3′,反义5′-TTGCCCCGATGTAATAAA-3′，产物209 bp；β-actin正义5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′,反义5′-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3′，产物381 bp，引物由上海生工公司合成。PCR条件：94℃ 4 min， 94℃ 30 s、56℃ 40 s、72℃ 40 s，30次循环，72℃ 5 min。产物经电泳分离、扫描，以PTEN与β-actin条带灰度比值表示mRNA相对表达量。

2．免疫细胞化学法：细胞行爬片培养，应用PV9000二步法免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司)检测细胞PTEN、VEGF和EGFR蛋白的表达。鼠抗人VEGF、PTEN抗体购自Santa Cruz公司，鼠抗人EGFR单抗购自福州迈新生物公司。

3．细胞周期检测：取各组细胞，PBS洗涤后，-20℃乙醇4℃固定，加入核糖核酸酶及碘化丙啶染色，上FACScan流式细胞仪，用488 nm激发光测细胞周期。设3个平行样，重复一次，取均值。

4．细胞克隆形成率：取各组细胞，逐级稀释后接种于培养皿，常规培养14 d，乙醇固定，结晶紫染色，计数细胞克隆≥50个细胞，计算克隆形成率(PE)。PE=克隆形成数/接种细胞数。

5．Transwell小室侵袭实验：将各组细胞分别加入Transwell小室上层，下层加600 μl含1%胎牛血清的DMEM培养基及作为趋化因子的HGF，常规培养16 h，取出滤膜，擦去上层面细胞，中性甲醛固定，苏木素染色，高倍镜下观察5个高倍视野，计穿膜细胞数。实验设3个平行样，并重复一次，取均值。

6．裸鼠种植瘤形成及转移：取20只4～6周龄 Balb/C裸鼠，按完全随机法分为A-pE-P组和ASPC-1组，各10只。每只裸鼠腹股沟皮下注射1×107个肿瘤细胞。1、5周后处死小鼠，测量肿瘤体积，记录转移灶。肿瘤体积=1/6×π×长径×短径2。

三、统计学处理

结 果

一、细胞PTEN mRNA表达

ASPC-1、A-pE和A-pE-P细胞PTEN mRNA相对表达量分别20.33±9.42、14.97±8.17、56.77±16.85(图1)， A-pE-P细胞的表达较ASPC-1细胞增强179.3%(F=20.35,P<0.01)。

图1 ASPC-1、A-pE、A-pE-P细胞PTEN mRNA表达

二、细胞PTEN、VEGF和EGFR蛋白表达

ASPC-1、A-pE细胞低表达PTEN，高表达VEGF；A-pE-P细胞高表达PTEN，低表达VEGF；3组细胞EGFR表达无明显差异(图2)。

图2A-pE(上)、A-pE-P(下)细胞的PTEN(a)、VEGF(b)、 EGFR(c)蛋白表达(免疫组化 ×200或400)

三、细胞周期、克隆形成率

A-pE-P细胞G2/M、S期细胞较ASPC-1、A-pE细胞显著增多；G1期细胞减少(表1)。ASPC-1、A-pE、A-pE-P细胞的克隆形成数分别为(33.3±3.4)、(31.7±4.3)、(24.0±3.9)个，A-pE-P组较ASPC-3组降低了28.0%(F=4.283,P<0.05)。

表1 各组ASPC-1细胞周期的分布

四、细胞体外侵袭能力

ASPC-1、A-pE、A-pE-P组的穿膜细胞数为(63.8±7.5)、(61.5±6.3)、(46.3±6.6)个，A-pE-P组较ASPC-3组显著减少(F=2.476，P<0.05)。

五、种植瘤生长及转移

细胞接种1周后，A-pE-p、ASPC-1组裸鼠均出现瘤结节，成瘤率100%，瘤体积为(1.3±0.1)mm3和(1.4±0.2)mm3，无显著差异，均未发现转移灶；5周时，A-pE-p组瘤体积为(142.4±30.9)mm3，显著小于ASPC1组的(202.7±43.6)mm3(t=4.834，P<0.01)，抑瘤率达42.4%。A-pE-P组发现转移灶(2.0±0.7)个，显著低于ASPC-1组的(5.0±1.3)个(t=0.451，P<0.01)。转移以肺脏、腋下和腹股沟淋巴结为主，仅1只出现腹腔转移。

讨 论

PTEN参与细胞分裂、增殖、侵袭、转移、炎症反应及ECM代谢等多种生物学过程[1]。PTEN编码双重底物特异性磷酸酶，具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性，其蛋白磷酸酶活性在抑制肿瘤细胞侵袭、转移过程中起主要作用[2-3]，PTEN可通过抑制PIP3激酶活性，阻断Akt的作用[4]，使细胞阻滞在G2/M期，同时启动凋亡程序，抑制肿瘤细胞增殖[5]。

本研究结果显示，转染PTEN的ASPC-1细胞明显被阻滞在G2/M期，并有部分细胞产生凋亡，与Saito等[6]的研究结果一致。但有研究结果显示，PTEN使细胞阻滞在G1期。这种分歧可能因PTEN对细胞周期的调节有细胞型和剂量依赖性的差别。此外，转染PTEN的ASPC-1细胞VEGF蛋白表达明显减弱，而EGFR蛋白表达水平无明显改变，表明PTEN可抑制VEGF的表达，而与EGFR表达无关。

本实验结果还显示，种植A-pE-P细胞的裸鼠，瘤块生长缓慢，转移灶数目减少，表明PTEN蛋白的过表达可能通过减少细胞VEGF蛋白的表达达到抑制肿瘤细胞生长及转移的能力。

[1] Chu EC, Tarnawski AS. PTEN regulatory functions in tumor suppression and cell biology. Med Sci Monit, 2004,10: RA235-RA241.

[2] Rinker-Schaeffer CW,O′Keefe JP,Welch DR, et al.Metastasis suppressor proteins: discovery,molecular mechanisms,and clinical application.Clin Cancer Res,2006,12: 3882-3889.

[3] Okumura K, Zhao M, DePinho RA, et al. PTEN: a novel anti-oncogenic function independent of phosphatase activity. Cell Cycle,2005, 4: 540-542.

[4] Kandel ES, Skeen J, Majewski N, et al. Activation of Akt/protein kinase B overcomes a G2/M cell cycle checkpoint induced by DNA damage. Mol Cell Biol, 2002, 22: 7831-7841.

[5] 杨志芳,易继林,李兴睿,等. PTEN依赖其磷酸酶活性诱导肝癌发生失巢凋亡机制的探讨.中华肿瘤杂志, 2005,27:273-275.

[6] Saito Y, Swanson X, Mhashilkar AM, et al. Adenovirus-mediated transfer of the PTEN gene inhibits human colorectal cancer growth in vitro and in vivo. Gene Ther, 2003, 10: 1961-1969.

HeterogeneousPTENinhibitsASPC-1cellproliferation,invasionandmetastasis

LIHong-yu,LIJian-jun,LIUXu,WUChun-yan,ZHAOJia-jun,CHENYan-zhi,GUOXiao-zhong.
DepartmentofGastroenterology,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110840，China

GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of heterogeneous phosphatase and tensinhomologue deleted on chromosome ten (PTEN) on cell cycles, proliferation, invasion, tumorigenicity, metastasis and the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor receptor (EGFR) proteins in human pancreas cancer cell line (ASPC-1).MethodsASPC-1 cells was transfected with plasmid pE-PTEN containing PTEN, and empty plasmid pE-PTEN transfection was used as control, then ASPC-1-pE-PTEN (A-pE-P) cell and ASPC-1-pE (A-pE) cell was obtained. The expression of PTEN mRNA was determined by RT-PCR. PTEN, VEGF and EGFR proteins were measured by cell immunohistochemical method. Clone formation assay was used to observe the numbers of clone. Transwell was used to test the invasion ability of cells. The growths of tumor were detected by nude mice subcutaneous injection of cancer cells in vivo.ResultsCompared with ASPC-1, the expressions of PTEN mRNA of A-pE-P increased by 179.3%, and the expressions of PTEN protein were also significantly increased. The expressions of VEGF protein were significantly decreased. The expressions of EGFR protein were not significantly changed. Number of G2/M phase cells was significantly increased from (26.81±1.03)% to (31.5±1.76)% (P<0.05). The numbers of clone was decreased by 28%(P<0.05). The number of penetrating cells was decreased [(46.3±6.6)vs(63.8±7.5) per high power field,P<0.05]. The tumor volumes were significantly reduced [(142.4±30.9)vs(202.7±43.6) mm3,P<0.05]. The tumor inhibitory rate was 42.4%. The distant metastases were significantly reduced [(2.0±0.7)vs(5.0±1.3),P<0.01].ConclusionsHeterogeneous PTEN can not only inhibit the proliferation, invasion and metastasis of ASPC-1 cells, arrest the cell growth at G2/M phase, but also decrease the expressions of VEGF.

Pancreatic neoplasms; Gene, tumor suppressor; Transfection; Phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.005

辽宁省博士启动基金(20081044)；辽宁省教育厅基金(L2010627)

110840 沈阳，沈阳军区总医院消化内科(李宏宇、郭晓钟、刘旭、吴春燕、赵佳钧)；中国医科大学附属第一医院放疗科(李建军、陈延志)

郭晓钟，Email: guoxiaozhong1962@163.com

2011-04-27)

(本文编辑：吕芳萍)