预处理舒芬太尼对缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响及相关Bcl－2、Bax蛋白的表达

李晓录，赵国庆，高 明

（吉林大学中日联谊医院 麻醉科，吉林 长春130033）

舒芬太尼以其对血流动力学干扰较轻，起效快，消除半衰期较短.镇痛效能更强的特点倍受临床医生的青睐，广泛应用于临床，尤其适用于心血管手术麻醉。现已证实预处理舒芬太尼可减轻心肌缺血再灌注损伤［1］，对心肌有保护作用，但其对心肌细胞凋亡的影响却鲜有报道。本实验旨在通过检测大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白的表达情况，以探讨舒芬太尼预处理与心肌细胞凋亡的关系，为心脏手术和心脏病人非心脏手术围术期用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型的制备 健康雄性SD大白鼠40只，体重200－300g。所有实验大鼠术前均禁食12h，可自由饮水。大鼠称重、麻醉后固定于实验台，于大鼠胸骨左缘第3－4肋间逐层钝性分离开胸，暴露心脏，剪开心包膜，在左心耳下方1－2mm处以线做套环，稳定15min以备实验用。收紧结扎线即形成左冠状动脉闭塞心肌缺血，松开结扎线即形成再灌注。心肌缺血成功标志为：心电图ST段明显抬高并且结扎线以下心肌组织颜色由正常变苍白再变暗。

1.2 分组与处理 所有实验大鼠随机分为4组，每组10只。①假手术组（（S组空白对照），开胸后穿线做套环，但不结扎；②单纯缺血再灌注组（I／R组），结扎缺血30min，放松结扎线后行再灌注120 min；③缺血预处理组（IPC组），采取结扎左冠状动脉前给予三次5min缺血、5min再灌注，而后操作重复I／R组；④预处理舒芬太尼组（SPC组），于结扎左冠状动脉前分别采用微量泵静脉泵注舒芬太尼（0.5μg／kg）5min、停5min，重复预处理3次，以后操作同I／R组。

1.3 指标观察 心肌细胞凋亡检测：具体步骤按心肌细胞凋亡的原位末端标记检测（TUNEL）法说明书进行。光镜下观察，细胞核呈棕褐色染色即为TUNEL阳性。凋亡细胞记数时，采用ImagePro Plus 4.5图象分析软件，随机选取5个无重叠之高倍镜视野（40X），计数其凋亡阳性细胞核数及总细胞核数，按公式［凋亡指数（AI）＝凋亡心肌细胞核数／心肌细胞核总数X 100%］计算心肌细胞凋亡指数，取其平均值即为心肌细胞凋亡率。

免疫组织化学法检测心肌组织Bcl－2、Bax蛋白含量：取心尖上1 mm处心肌常规制备石蜡切片，免疫组织化学具体步骤按PV二步法说明书进行。Bcl－2、Bax蛋白表达结果的观察：光镜下，细胞浆呈棕黄色或棕褐色染色的即为阳性，不染色者为阴性。采用ImagePro Plus 4.5图象分析软件半定量分析Bcl－2和Bax的表达量，在校正光密度后每张切片随机取5个高倍镜（40X）下无重叠之视野，测定其阳性反应的平均光密度（OD），以平均光密度（OD）代表含量密度。

1.4 统计学处理 计量资料用均数±标准差（±s）表示，用 SPSS13.0统计软件处理。用one－way ANOVA方法进行组间统计学分析比较。P＜0.05有统计学差异，P＜0.01为有非常显著统计学差异。

2 结果

2.1 各组大鼠缺血再灌注心肌TUNNEL细胞计数各组心肌细胞凋亡指数结果分析可见，与S组比较其余三组凋亡指数明显增高（P＜0.01），与I／R组比较IPC组和SPC组心肌细胞凋亡指数明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 各组大鼠缺血再灌注心肌TUNEL染色结果各组切片在光镜下均可见到TUNEL阳性细胞，其中S组仅呈散在少量分布，而其余三组在心肌缺血／再灌注后则明显增多，尤以I／R组凋亡心肌细胞数量增多明显，且成群分布。IPC组和SPC组凋亡心肌细胞明显少于I／R组，介于S组与I／R组之间（图1）。

表1 各组大鼠心肌细胞凋亡变化的比较

2.3 Bcl－2、Bax蛋白免疫组化染色及半定量分析光镜下可见阳性的Bcl－2蛋白在胞浆内呈棕褐色片状表达，而Bax蛋白则积聚于胞浆内，呈棕黄色染色。与S组相比，其余三组Bcl－2、Bax蛋白的表达明显增多，OD值显著增高，组间比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）。IPC组和SPC组的Bcl－2蛋白表达OD值明显高于I／R组，而Bax蛋白表达OD值则显著降低（P＜0.01）。Bcl－2／Bax蛋白表达的比值，I／R组明显低于S组 （P＜0.01or P＜0.05），IPC组与SPC组显著高于I／R组 （P＜0.01）（表1，图2，3）。

图1 TUNEL染色结果 （A：S组 偶见散在的棕色凋亡细胞；B：I／R组 凋亡细胞成群分布；C：IPC组 棕色凋亡细胞明显减少；D：SPC组 棕色凋亡细胞散在分布）

图2 Bcl－2免疫组化（40×）（镜下可见Bcl－2蛋白表达呈棕褐色，分布于胞浆。A：S组；B：I／R组；C：IPC组；D：SPC组）

图3 Bax免疫组化，（40×）（镜下可见Bax蛋白表达呈棕黄色，分布于胞浆中。A：S组；B：I／R组；C：IPC组；D：SPC组）

3 讨论

心肌缺血／再灌注损伤（MIRI）是一种比较复杂且广泛的病理生理过程，缺血的心肌在恢复其血供的过程中会增加心肌原有的损害，严重影响缺血后心脏功能的恢复，对围术期病人的生活质量甚至生命造成巨大的威胁。细胞凋亡，又称细胞程序性死亡（programmed cell death），近年来研究表明其在诱发心肌缺血再灌注损伤的过程中发挥重要作用［2］，因此如何减少细胞凋亡就成为摆在我们面前的首要难题。

本实验病理结果观察到S组偶见凋亡细胞，I／R组出现大量的心肌细胞凋亡，而IPC和SPC组细胞凋亡明显少于I／R组，可见，心肌缺血再灌注损伤有加重心肌细胞凋亡的作用。通过对4组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较，我们不难看出IPC和SPC组的心肌细胞凋亡指数明显低于I／R组，说明缺血预处理与舒芬太尼预处理均有相同的心肌保护作用。虽然IPC组的心肌细胞凋亡指数较SPC组略低，但缺血预处理本身是一种损伤因素，有其局限性，临床应用价值较低，因而预处理舒芬太尼就成为心肌保护的首选。

细胞凋亡受多种调节基因的控制，在与细胞凋亡有关的基因中，Bcl－2家族是重要的抗凋亡基因，在MIRI中起主导地位，其中Bcl－2是最主要的抗凋亡基因，而Bax的作用则正好相反，其表达则可促进细胞凋亡。两者的比值决定着细胞是否发生凋亡。本实验结果显示IPC组与SPC组的Bcl－2蛋白表达均较I／R组明显升高，而Bax蛋白表达则明显降低，Bcl－2／Bax比率较I／R组明显上升，再次说明两种预处理方法均有抗凋亡作用，均可通过上调Bcl－2蛋白与下调Bax蛋白的表达，以达到抗凋亡的目的。

阿片类药物抗心肌细胞凋亡的机制，可能是通过激活心肌细胞δ受体，从而激活细胞外信号调节激酶，促进细胞内生存素的表达，从而促进Bcl－2表达和抑制Bax表达，同时开放线粒体ATP敏感性钾通道，从而抑制细胞凋亡［3］。在阿片类制剂中舒芬太尼的镇痛效应最强，其主要激动μ受体，同时也激动δ、κ阿片受体，本研究推测舒太尼预处理可能通过激活心肌δ受体，调节Bcl－2与Bax蛋白的表达发挥其抗凋亡作用，对心肌的MIRI损伤产生保护作用。

心肌低灌注、缺血和复流、再灌注损伤是心脏手术与心脏病人非心脏手术围术期发生各种心脏危险事件的最常见原因。结合本实验的研究结果我们不难看出，舒芬太尼有较强的心肌保护作用，在围术期预处理舒芬太尼可预防心肌缺血，增加心肌对缺血的耐受力，显著降低各种心脏危险事件的发生，提高手术安全及预后，有极其广泛的临床应用价值。

［1］张冬梅，侯春丽，常业恬，等.舒芬太尼预处理对缺血再灌注大鼠心肌梗死范围及心肌酶的影响［J］.实用医学杂志，2009，25（15）：2430.

［2］Freude B，Masters TN，Robicsek F.et al.Apoptosis is initiated bymyocardial ischemia and executed during reperfusien［J］.J Mol Cell Cardiol，2000，32（2）：197.

［3］Yao LL，Wang YG，Cai WJ，et al.Survivin mediates the anti—apoptoticeffect of delta—opioid receptor stimulation in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120：895.