CCK法检测紫草素及衍生物对血液肿瘤细胞株的增殖抑制作用

钟济华，成玲剑，周 文，张义炜，钟 华，黄洪晖，陈芳源＊

（1.上海交通大学医学院附属仁济医院 血液科，上海200001；2.上海交通大学药学院，上海200240）

紫草为传统中药，具有广泛的药理作用，抗瘤作用是其中之一。天然紫草素结构中，萘醌环对其药物活性非常重要，但因其结构本身易通过氧化还原产生活性氧，导致细胞毒作用较大且易杀伤正常细胞，限制了其在临床上的应用。为了提高紫草素类化合物的抗癌活性，增加其选择性，人们在天然紫草素的基础上进行结构修饰与改造，合成了一些紫草素衍生物，它们大多集中侧链的不同位置加入各种基团，比如硫醚、硫酯、醚、酯等，研究发现这些人工改造和修饰得到紫草素及衍生物能不同程度改善其抗肿瘤作用性状［1－3］。本研究用 Cell Counting Kit－8（简称 CCK－8）法测定天然紫草素 （shikonin，SK01），天 然 β－羟 基－异 戊 酰 紫 草 素 （β－hydroxyisovalerylshikonin，SK17）及其16种人工半合成的紫草素衍生物对常用血液肿瘤细胞株的增殖作用即药物半数抑制浓度（50%concentration of inhibition，IC50），从中筛选出高效低毒的紫草素类化合物，以期为紫草素及衍生物对血液肿瘤的进一步实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：HL－60细胞株（人急性髓系白血病），NB4细胞株（人急性早幼粒白血病细胞），Raji细胞株（人Burkitts淋巴瘤细胞），U937细胞株（人单核细胞系白血病细胞），THP－1细胞株（人单核细胞系白血病细胞），293T细胞株（人正常肾上皮细胞系）均来自本实验室，于液氮中保存，复苏后使用。

1.1.2 药物 紫草素、β－羟基－异戊酰紫草素及其衍生物（表1，图1）由上海交通大学药学院李绍顺教授馈赠，以纯品存于－80℃冰箱中。使用时溶于二甲基亚砜（DMSO：中国医药集团上海化学试剂公司）中，配成8 000μg／ml的储存液备用，然后用培养液稀释成工作浓度。

图1 紫草素及SK17结构

1.1.3 主要试剂与仪器 RPMI1640培养液（GIBCO公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK－8试剂盒（同仁化学研究所）；酶标仪（Thermo Labsystems，Multiscan MK－3）。

表1 紫草素、β－羟基－异戊酰紫草素及其16种衍生物的名称及分子量

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：细胞株以2×105／ml的起始浓度接种于含10%小牛血清的RPMI－1640培养液37℃、5%CO2条件下培养传代，选取对数生长期细胞用于实验研究。

1.2.2 CCK－8法测细胞增殖：取对数生长期细胞，制成2×105／ml悬液，按每孔100μl加入96孔培养板中，实验设空白对照组和阴性对照组及5种不同浓度药物组，终浓度分别为0.02、0.1、0.5、2.5、12.5μg／ml，每一浓度设4个复孔，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。48 h后取出96孔板，加入10μl的CCK－8，在相同条件下继续孵育1－4 h后，用酶标仪于490 nm处测定各孔的吸光度值，参比波长620 nm。实验重复3次，按（A对照－A实验）／A对照×100%计算药物对细胞的生长抑制率及IC50值。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计分析软件，结果均以表示。

2 结果

SK01、SK17对上述5种血液肿瘤细胞株及正常细胞株均有很强的细胞毒作用；紫草素－二甲醚衍生物SK36对上述5种血液肿瘤细胞株亦有很强的细胞毒作用，但对正常细胞株的毒性作用则明显低于SK01和SK17，表现出较好选择性。6种紫草素衍生物：SK11、SK12、SK13、SK37、SK40、SK42对一种或多种血液肿瘤细胞株有细胞毒作用且对正常细胞株293T无毒性作用；8种紫草素衍生物：SK14、SK15、SK16、SK32、SK33、SK41、SK48以及SK49，对上述5种血液肿瘤细胞株及正常细胞株均无细胞毒作用，IC50＞12.5μg／ml。实验中我们还发现大部分母核I衍生物抗肿瘤活性强于母核Ⅱ衍生物（表2）。

表2 SK01、SK17及其16种衍生物对6种细胞株的IC50值（μg／ml，n＝3，）

表2 SK01、SK17及其16种衍生物对6种细胞株的IC50值（μg／ml，n＝3，）

IC50 NB4 U937 HL－60 Raji THP－1 293T 12.5 SK12 4.23±0.04 10.96±0.08 3.76±0.00 1.64±0.07 ＞12.5 ＞12.5 SK13 7.47±0.06 3.39±0.009 1.09±0.01 ＞12.5 1.91±0.02 ＞12.5 SK14 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK15 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK16 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK17 1.73±0.01 0.93±0.01 0.78±0.03 3.02±0.01 0.75±0.06 9.59±0.26 SK32 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK33 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK36 3.26±0.08 0.86±0.02 0.90±0.27 5.92±0.056 1.02±0.19 ＞12.5 SK37 4.63±0.07 1.70±0.38 6.47±0.70 11.33±0.01 ＞12.5 ＞12.5 SK40 ＞12.5 ＞12.5 2.39±0.05 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK41 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK42 8.81±0.06 9.88±0.07 6.70±0.08 ＞12.5 ＞12.5 11.00±0.30 SK43 ＞12.5 ＞12.5 8.28±0.09 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK48 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK49 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 ＞12.5 SK01 0.83±0.03 1.02±0.02 0.27±0.01 1.63±0.0 SK 118.49±0.01 2.80±0.08 1.58±0.04 ＞12.5 9.50±0.82 ＞1 1.60±0.09 2.32±0.07

3 讨论

上海交通大学药学院共设计合成了紫草素（SK01），β－羟基－异戊酰紫草素（SK17）及16种的紫草素衍生物，通过波谱分析确定了其化学结构。这16种紫草素衍生物是以SK01、SK17为先导化合物，旨在降低SK01、SK17泛细胞毒作用，针对其结构和药效特点，对其进行了化学结构修饰与改造。由表1，图1可见本文所设计紫草素衍生物主要集中在萘醌环羟基、侧链羟基引入不同类型酸以及萘醌环与侧链的链接位置改变。

尽管许多体内外研究表明［4］紫草素侧链1’位置引入不同酯基与抗肿瘤作用的增加有关，然而本实验所测试化合物并未呈现明显趋势与规律。从表2可以看出，紫草素母核羟基甲基化能有效降低细胞毒性，提高其对正常细胞293T的选择性，如SK11、SK12相对于SK01；然而侧链羟基引入不同酸，有的增强其抗肿瘤活性如SK36，SK37，相反有的其细胞毒作用稍微降低如SK42，有的甚至失去作用如SK14，15，16，32，33，40，41等，表现出与以前针对其它细胞株具有不一样的抗肿瘤构效关系。对所测肿瘤细胞株显示有活性的化合物来说，显示大部分母核I衍生物的活性好于母核Ⅱ衍生物。值得一提是，SK36，SK37的抗肿瘤活性较其它化合物的活性强得多，可能与引入酸中含有β－羟基有关，这趋势得到相关文献报道［5，6］的支持。

本文采用的CCK－8法是一种目前广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测法。与其它检测法相比线性范围更宽，检测灵敏度更高、更加稳定并且它对细胞无明显毒性，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间［7，8，9］。本实验选用的细胞株均为悬浮细胞，通过检测，我们认为CCK－8法应用于血液肿瘤悬浮细胞增殖实验，其最佳检测波长为490 nm，参比波长为620 nm；最佳检测时间为加入CCK－8试剂后2 h［对照组吸光度（A）大于等于1小于2即可］；适宜细胞数量范围为2×105／ml悬液。

本实验结果显示紫草素衍生物SK36对多种血液肿瘤细胞株有很强的细胞毒作用，但在对正常细胞293T的作用方面，SK36的毒性作用则明显低于SK01和SK17，提示人工半合成的紫草素衍生物SK36与天然紫草素及天然β－羟基－异戊酰紫草素相比较更为安全。已有实验证明人工半合成的紫草素衍生物具有比天然紫草素更强的抑制白血病等肿瘤细胞增殖的作用，在抗白血病方面，具有开发为一种新的高效低毒药物的潜能［10］。此外，上述还有一些紫草素衍生物目前在药物浓度0.02μg／ml－1.5μg／ml范围内都无明显活性，但如增大剂量、改变给药途径，并不排除从中发现有效药物的可能性。同时我们还可以采用通过体内动物模型的方式进行进一步的筛选。

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