DPC4基因转染对结肠癌SW480细胞的影响

谢忠士，谭 岩，宋 燕

（1.吉林大学中日联谊医院 结 直肠肛门外科，吉林 长 春130033；2.吉林省人民医院 医 学诊治实验中心，吉林 长 春130021）

大肠癌是一种常见的严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，在我国的各类恶性肿瘤中，大肠癌的发病率及死亡率居第四位。大肠癌的发生发展是多个基因事件共同作用的结果，其中既有癌基因的激活，也有抑癌基因的失活。在肠道肿瘤的发生、发展中，最重要的基因事件之一是人类染色体18q2的基因改变，18q2是肠道肿瘤中基因改变最频繁的区域，在这一部位已发现多个与大肠癌密切相关的抑癌基因，譬如 DCC（deleted in colorectal cancer），APC（adenomatous polyposis coli gene）等，而DPC4（deleted in pancreatic carcinoma，locus4）基因是位于人类染色体18q21.1发现的基因。作者通过DPC4／Smad4逆转录病毒p LXSN载体的构建，DPC4基因转染结肠癌细胞，MTT实验均提示结肠癌细胞SW480的生长受到明显抑制，初步探讨DPC4基因抑制肿瘤细胞生长的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 细胞：SW480细胞由吉林大学公共卫生学院所惠赠。载体：重组p LXSN／DPC4载体的构建吉林大学公共卫生学院，构建好的重组体经多种酶切鉴定分析和PCR鉴定，结果证实成功构建了重组p LXSN－DPC4逆转录病毒载体。主要试剂及仪器：TRIZOL Reagent：GIBCO公司产品。胰蛋白酶：Difco公司产品。超级小牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所。ABC试剂盒为美国Vector laboratory公司产品。琼脂糖：GIBCO公司；DMEM／F12：GIBCO公司；G418：GIBCO公司；Polybrene：Sigma公司；SDS、DEPC：Sigma公司；丙烯酰胺／甲叉丙烯酰胺：Sigma公司；胰蛋白酶：Difco公司；逆转录酶、TRIzo L、DMEM购自GIBCO公司；青霉素及链霉素：TAKARA公司；MTT：Sigma公司；Superscript TM逆转录试剂盒：GIBCO公司；脂质体Lipofectamine TM2000、DNA Ladder：美国Invitrogen公司；PCR扩增仪（Gene Amp，美国）；超净工作台（YZ－875苏州净化设备厂）；自动高压蒸气消毒器（SONY，日本）；低温冰箱（－80℃SANYO，日本）；恒温水浴箱（江苏常州国华仪器厂）；高速低温离心机（TOMY GRX－220，日本）。

1.2 方法 选择无DPC4表达的人结肠癌细胞系SW480为实验细胞，构建表达野生型DPC4基因的逆转录病毒p LXSN载体，转染结肠癌SW480细胞株，经G418筛选，获取稳定表达DPC4基因的子代SW480结肠癌细胞，以空载体p LXSN为阳性对照，分别命名为 SW480／DPC4、SW480／p LXSN 细胞；取母代SW480细胞为阴性对照，命名为SW480／－细胞。并经Western鉴定。运用MTT方法检测体外结肠癌细胞的生长情况的改变。

1.3 结果判断 Western显示在SW480／DPC4细胞中可见一大小约为60 KDa的DPC4蛋白条带。MTT体外检测癌细胞的生长情况。

1.4 数据处理 应用SPSS17.0统计软件进行处理。

2 结果

2.1 Western对DPC4蛋白的鉴定 Western显示在SW480／DPC4细胞中可见一大小约为60 KDa的DPC4蛋白条带；而在阳性对照SW480／p LXSN和阴性对照SW480／－细胞株，均未见该蛋白条带（见图1）。提示在SW480／DPC4细胞中已有DPC4蛋白的翻译。至此可以证实，本实验已成功将DPC4基因转移至结肠癌细胞SW480细胞中，成功获取了SW480／DPC4子代细胞株。

图1 Westen对SW480细胞中DPC4蛋白表达的测定

2.2 MTT体外检测癌细胞的生长情况

本实验 分别比较 了 SW480／DPC4、SW480／p LXSN、SW480／－细胞体外生长曲线（见图2），发现SW480／DPC4细胞较 SW480／p LXSN、SW480／－细胞，生长明显减缓，经统计有显著差异（P＜0.05）。培养第7天的时候，抑制率达50%左右。

3 讨论

图2 细胞生长曲线

在我国结肠癌的发病率逐年上升，经过多年的研究发现其与多种基因的突变有关，如p53，p16，DCC，C－myc等。在结肠癌中DPC4基因的突变率各家的报道不一，这可能和各家的样本量小以及各病例的病变程度不一有关。据报道，在幼年性息肉病变中发现有Smad4的胚系突变，在大肠癌中，Smad4突变主要包括移码突变、框内缺失、无义及错义突变。突变热点主要位于羧基端区域，往往使得Smad4负责形成纯聚体和杂聚体的蛋白区域发生突变，因而影响到Smad4的信号传导功能。Smad4的突变频率随着大肠癌的进展逐渐增高，表明其与大肠癌的演进及远处转移有关。MacGrogan［1］检测了9例结肠癌，发现有5例DPC4基因突变，突变率为54，其中有两例是在外显子1和8的错义突变，有两例是部分的纯合子缺失。Michiko［2］分析了176例处于不同病变阶段的结肠肿瘤，Smad4的突变包括了7例移码突变、4例无义突变及9例错义突变和I例缺失突变。Smad4的突变率在腺瘤是0%（0／40），在粘膜内癌是10%（4／39），在不伴转移的早期浸润癌中是7%（3／44），而在远处转移癌中是31%（11／36）。在伴Smad4的浸润、转移性肿瘤中同时伴有其他等位基因的缺失。因而他认为DPC4作为抑癌基因，它的失活不仅诱导了肿瘤的发生，而且还促进了肿瘤的发展。Ohtaki N等［3］认为Dpc4基因改变可能在结直肠癌的肿瘤形成和肝转移过程中起到一定的作用。Taketo MM等［4］在Smad4突变鼠的研究中也认为Smad4突变在结直肠肿瘤的恶变过程中起了重要的作用。Maitra等［5］在用免疫组化检测83例结直肠肿瘤组织，包括19例腺瘤，64例腺癌（其中一期11例，二期13例，三期17例，四期23例）。结果显示腺瘤及一期腺癌无DPC4蛋白缺失，而二期腺癌的缺失率为8%（1／13），三期腺癌的缺失率为6%（1／17），四期腺癌的缺失率为22%（5／23），因而认为Dpc4基因的失活在结直肠癌的发病机制中可能是晚期事件。

本实验观察到，DPC4基因成功转染入SW480细胞，在体外可以抑制结肠癌细胞SW480生长，MTT显示体外生长明显受到抑制，7天以后抑制率可以达到50%左右。这可以说明DPC4基因在结肠癌细胞中重获表达，可以抑制癌细胞的生长，降低侵袭能力和恶性程度。其中的机理可能还是与TGF－β信号通路的恢复有密切的关系，但具体机制需进一步实验证实。

［1］Macgrogan，D，Pegram M，Slamon D，et al.Comparative Mutational Analysis ofin Prostatic and Colorectal carcinomas［J］.Oncogene，1997，15（9）：1111.

［2］Michiko M，1i jima T，Konishi M，et al.Higher frequency of Smad4 gene mutation human colorectal cancer with distant metastasis［J］.Oncogene，1999，18（20）：3098.

［3］Ohtaki N，Yamaguchi A，Goi T，et al.Somatic alterations of the DPC4 and Made2genes in colorectal cancers and relationship to metastasis［J］.Int J Oncol，2005，18（2）：265.

［4］Taketo MM，Takaku K.Gastrointestinal tumorigenesis in Smad4（Dpc4）mutantmice［J］.Department of Pharmacology，2004，13，（3）：85.

［5］Maitra A，Molberg K，Albores－Savedra J，et al.Loss of DPC4expression in colonic adenocarcinomas correlates with the presence of metastatic disease［J］.Am Pat Hol，2007，157（4）：1105.

［6］Ke Z，Zhang X，M a L，et al Deleted in pancreatic carcin0ma locus4／Smad4 participates in the regulation of apoptos by affecting the Bcl－2／Bax banlance in non－small cell lung cancer［J］.Hum Pathol 2008，39（10）：1438.