体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

孙庆国，赵文静，王日中，陈 锋

（吉林省肝胆病医院 检验科，吉林 长春130062）

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是骨髓中一类具有多分化潜能的干细胞，在一定诱导条件下不仅可分化为中胚层的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞，而且能分化成外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞［1－4］。MSCs向心肌细胞的分化为扩张性心肌病、心肌梗死等的治疗带来了新的希望［5］。研究证明，5－氮胞苷（5－aza）可诱导MSCs向心肌样细胞分化，但如何促进MSCs向心肌细胞分化仍是需要重点研究的问题，为此本研究分离培养大鼠骨髓MSCs，并采用扩张性心肌病大鼠血清和5－氮胞苷诱导培养骨髓MSCs，为MSCs向心肌细胞分化选择最适微环境提供实验基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

DMEM培养基（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青生物技术公司）；胰蛋白酶（Introvigen）、5－氮胞苷（Sigma）；淋巴细胞分离液（密度：1.077，上海试剂二厂，中国），SD大鼠（吉林大学基础医学院医学动物实验中心），兔抗大鼠肌钙蛋白（cTnT）单抗（丹麦DAKO公司），SP免疫组化染色试剂盒（福州迈新生物技术公司）。

1.2 大鼠骨髓MSCs的分离培养

选用8天SDE大乳鼠4只，断头处死，无菌分离股骨和胫骨，冲洗骨髓腔制成细胞悬液，淋巴细胞分离液密度梯度离心分离单个核细胞，接种2×106个单个核细胞于10cm培养皿中，37℃、5%CO2培养48h后换液，培养约10～14天细胞接近融合时按1∶4传代，并标记为Passage1（P1）；重复以上操作，传代培养。

1.3 大鼠骨髓MSCs的表型鉴定

取3代MSCs细胞1×104个／孔接种于24孔培养板中（孔中预先放置无菌盖玻片），37℃、5%CO2培养，待MSCs生长接近80%融合时，取出盖玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定15min，蒸馏水冲洗，免疫细胞化学染色检测MSCs细胞表面标志CD44、CD29的表达，严格按照说明书进行操作。

1.4 扩张性心肌病大鼠模型血清＋5－aza诱导培养大鼠MSCs

按照参考文献［6］方法建立扩张性心肌病大鼠模型，造模成功后无菌腹主动脉采血，分离血清，－80℃冰箱保存备用。取第3代大鼠MSCs，以细胞浓度2×105／孔接种于6孔板内（孔内预置无菌盖玻片），过夜培养后实验组采用5μmol／L 5－aza干预培养24h后弃去培养液，改用含20%扩张性心肌病大鼠血清的低糖DMEM继续培养；对照组始终采用常规培养基同等条件下培养，每3～4天换液一次，于加入扩张性心肌病大鼠血清后1、2、3、4周取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，－20℃保存待检。

1.5 免疫细胞化学染色检测MSCs cTnT的表达

取出已固定细胞爬片，室温放置30min，PBS冲洗后，免疫细胞化学染色检测cTnT的表达（兔抗大鼠肌钙蛋白单抗1∶200稀释），结果判定：MSCs胞浆内出现棕褐色颗粒为阳性。显微镜下每组观察计数5个低倍视野，计算阳性细胞百分率。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分离培养和表型鉴定

淋巴细胞分离液密度梯度离心后获得的单个核细胞培养48小时后，部分细胞贴壁，并有少部分细胞已开始分裂增殖（图1A、B），随着培养时间的延长，细胞集落不断增多，扩大，培养约10～14天细胞达80%融合。传代骨髓MSCs很快贴壁，呈梭形，增殖迅速，约6～7天即可传代培养。

图1 Morphological features of rat BMSCs（×40）

骨髓MSCs具有特征性的表面标志，其特点是不表达造血干细胞的表面标志CD34和CD45，表达CD29、CD44、CD105和CD166等间充质干细胞的特异性表面标志［7］，免疫细胞化学染色结果显示表明：本研究分离培养的骨髓MSCs高表达CD44和CD29（图2），不表达CD34。

图2 The expression of CD44and CD29in rat BMSCs（×100）

2.2 扩张性心肌病大鼠模型血清＋5－aza诱导培养MSCs的形态学观察和cTnT的免疫组化染色结果

对照组大鼠骨髓MSCs未发生形态改变，呈成纤维细胞样整齐排列，培养第7天即长满瓶底；扩张性心肌病大鼠模型血清＋5－aza诱导培养组大鼠骨髓MSCs生长良好，7天后细胞形态即发生变化，体积变大，紧密平行排列生长，而且随着培养时间的延长，梭形细胞的比例下降，细胞多呈杆状，少数细胞呈不规则外形，相邻细胞间的胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状。

扩张性心肌病大鼠模型血清＋5－aza诱导组MSCs诱导培养7、14、21、28天cTnT均呈阳性表达，其表达阳性率分别为（18.4±3.2）%、（24.5±4.8）%、（50.8±6.7）%和（75.4±10.5）%，结果表明随时间延长表达阳性率增高，不同时间点阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）；未经5－aza诱导的B MSCs中未见cTnT表达（图3）。

图3 Morphological features and cTnT expressiojn of rat BMSCs in DCM rat serum group（×100）

3 讨论

MSCs在骨髓中的含量极少，仅占骨髓细胞的0.001%－0.01%［8］，需要在体外进行分离扩增培养才能满足细胞移植的需要。分离骨髓MSCs的分离方法主要有4种：密度梯度离心法贴、壁培养法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。本研究采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养大鼠骨髓MSCs，研究结果显示，密度梯度离心获得的单个核细胞培养48h后部分细胞贴壁，并呈集落式生长，传代细胞再形成集落式生长，呈均匀有序的成纤维细胞样细胞生长，传代周期为6－7天。主要从细胞的形态和培养特性、表面细胞标志的表达以及分化潜能3个方面鉴定MSCs，本研究采用免疫细胞化学染色检测大鼠骨髓MSCs的表型，结果表明分离培养的细胞高表达CD44和CD29，CD34表达阴性。结果显示本研究获得较纯化，高活性的BMSCs，与文献报道一致，为进一步实验奠定了基础。

MSCs可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞，目前MSCs已经成为治疗心血管疾病的种子细胞［9］，成为心血管疾病领域的研究热点，5－aza是目前公认的可以诱导MSCs向心肌细胞分化的药物，但有文献报道5－aza在诱导MSCs分化为心肌细胞的同时，其可以诱导 MSCs的凋亡［10－12］。同时大量研究结果表明，体外模拟心肌微环境，可高效诱导MSCs分化为心肌细胞。cTnT是心肌肌钙蛋白中具有较高特异性的亚型，是鉴定心肌源性细胞的特异性标志物［13］，本研究在体外采用扩张型心肌病大鼠模型血清＋5－aza对MSC进行诱导，并采用免疫细胞化学染色方法鉴定cTnT的表达，结果显示扩张型心肌病大鼠模型血清＋5－aza诱导培养组BMSCs生长状态良好，7天后细胞的形态即发生明显变化，并随着培养时间的延长呈杆状，排列具有方向性，逐渐相连呈肌管状，免疫细胞化学染色结果显示诱导组 MSCs的cTnT呈阳性表达，而未经5－aza诱导BMSCs中未见cTnT表达，本研究在体外找到更适宜诱导BMSCs向心肌细胞分化的条件，为进一步实验奠定了基础，相关研究正在深入进行中。

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