jck多囊肾小鼠肾囊泡上皮细胞MAPK信号通路上调

阚秀芳，赵丽晶，李 浩，李丁洋，邵 晨，谢爱国，赵丽娟＊

（1.长春市第二医院 内科，吉林 长春130062；2.吉林大学基础医学院病理生理学系；3.沈阳军区空军招收飞行学员体检队）

常染色体显性遗传多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一种较常见的单基因遗传性疾病，在人群中发病率高达1／1000－1／400，占我国终末期肾衰竭病因的第4位。ADPKD病变以双肾多发性进行性囊泡为主要特征，继发引起肾功能改变，终末期导致肾衰。ADPKD病程长，给病人和社会造成的经济负担较大。目前，除应用肾移植和透析治疗终末期肾衰，尚无能够阻止囊泡的发生和生长的有效药物［1－2］。因此，针对ADPKD的发病机制，寻找预防或延缓ADPKD发病甚至逆转其病程的新药物是该领域的研究热点。

我们的前期研究结果表明：8周龄jck小鼠肾脏显著增大，出现多发、大小不一的肾囊泡。囊泡上皮细胞呈扁平状，提示由于囊液过度分泌引起的囊内压增加所致。jck肾囊泡上皮细胞表达AQP2、AQP3和AQP4，提示其肾囊泡上皮细胞来源于肾集合管，并具有肾集合管的功能特性［3］。

目前认为多囊肾病肾囊泡的发生和进展主要是三个病理过程共同作用的结果：肾小管上皮细胞过度增殖、囊泡内液体的积聚和细胞外基质的重构［4，5］。激活腺苷酸环化酶（AC）可以使细胞内cAMP增加，激活PKA，在生长因子和细胞内低钙的共同作用下，通过激活 Raf－1／B－Raf－MEK－ERK通路，促进细胞增殖。但MAPK在jck多囊肾动物模型多囊肾囊泡发生发展中的作用尚未见报道。

本研究拟应用jck PKD小鼠模型，评价信号通路蛋白在jck小鼠肾囊泡上皮细胞的调控，确定jck PKD肾囊泡上皮细胞异常增殖过程中，细胞内信号转导通路所起的作用，为研究肾囊泡生成和增大机制，探讨抑制PKD囊泡增大的药物作用靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos和β－actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自美国Sigma公司，ECL Plus试剂盒购自Amersham公司。

1.2 动物模型 杂合子jck PKD小鼠模型购于Jackson Lab，洁净级条件饲养，经杂合子相互交配获得纯合子小鼠。12周龄时称体重，取雄性小鼠血进行血尿素测定，分离肾脏进行肾脏指数、肾脏组织学、蛋白表达调控分析。同窝雄性野生型小鼠作对照。

1.3 组织学观察 将肾脏组织标本用10%甲醛固定后，石蜡包埋、切片，然后进行苏木精伊红（HE）染色。光学显微镜下观察、照相。

1.4 Western blot 肾组织超声匀浆30s，用Biorad蛋白定量试剂盒对样品进行蛋白定量。配制12%SDS－PAGE凝胶，取20μg蛋白质样品，加入等体积2×上样缓冲液，100V恒压电泳，采用Bio－Rad转膜仪将蛋白样品转移至PVDF蛋白转移膜上，再将PVDF膜置于5% 脱脂奶粉中室温封闭60 min。TBS－T漂洗2次，加入1∶500倍稀释的抗H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos、和 β－actin多克隆抗体，4℃下反应过夜，TBS－T洗膜10 min×3次，加入1∶10 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育30min，TBS－T洗膜。ECL Plus试剂盒显影。

2 结果

2.1 jck PKD小鼠表型 12周龄jck纯合子小鼠体重明显低于同窝野生型小鼠（图1A），可见腹部明显增大，活动受限。jck纯合子小鼠的肾脏指数大于野生型小鼠肾脏4倍以上（P＜0.01，图1B）。血尿素水平在jck纯合子小鼠超过60mM，为野生型的7倍以上（P＜0.01，图1C），提示已出现严重的肾功能损伤。

2.2 jck PKD小鼠肾脏组织形态 12周龄jck纯合子小鼠肾脏组织表现多发、大小不一囊泡，囊泡上皮细胞呈扁平状，肾囊泡占肾组织的90%以上（图2A）。而同窝野生型小鼠肾脏则呈现正常肾组织结构（图2B）。

2.3 MAPK信号通路蛋白在肾脏的表达调控Western Blot分析结果表明，jck肾脏表达的 HRas、p－Raf、p－MEK、pERK 和c－fos蛋白水平与野生型肾脏相比明显上调，表明囊泡上皮细胞表达的Raf、MEK、ERK在jck肾脏的磷酸化明显高于其在野生型肾脏的表达水平，其可能是MAPK通路激活所致。见图3。

图1 jck小鼠表型

图2 jck纯合子小鼠肾脏异常

图3 MAPK信号通路在多囊肾组织调控分析

3 讨论

目前已经发现多个基因自发突变可引起小鼠PKD。这些PKD小鼠模型多为常染色体隐性遗传，但其病理学特征类似人常染色体显性遗传PKD［6］，常被用作PKD模型研究PKD的发病机制和研发治疗PKD候选药物。小鼠常染色体隐性遗传病（juvenile cystic kidney，jck）是一常用PKD小鼠模型［7，8］。jck纯合子小鼠3天龄时出现肾囊泡，4－5周龄时发展成明显多囊肾病，发病小鼠可存活4个多月。

大量的动物体内外实验和来源于人ADPKD肾脏标本的研究结果均表明：cAMP介导的信号通路是调节肾小管上皮细胞表型变化（过度增殖）和囊液积聚的最主要信号通路。目前研究已发现Ras－BRaf－MEK－ERK信号通路在ADPKD的发病过程中起着重要的作用。在ADPKD上皮细胞中，高水平的细 胞 内 cAMP 通 过 促 进 Ras－B－Raf－MEK－ERK信号通路促进囊泡上皮细胞的增殖和生长。在ADPKD上皮细胞中，囊泡上皮细胞内Ca2＋水平降低，PI3K－AKT途径对B－Raf的抑制作用减弱，导致EGF等生长因子主要通过 Ras－B－Raf－MEK－ERK信号通路，上调周期蛋白 Egr－l，c－myc，c－fos等细胞增殖相关基因的表达水平，促进囊泡上皮细胞的异常增殖［9］。我们的实验结果表明jck小鼠肾脏囊泡上皮细胞 MAPK通路中的 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK和c－fos蛋白水平与野生型肾脏相比明显上调，表明Raf、MEK、ERK在jck肾脏囊泡上皮细胞显著磷酸化。这些结果证实jck肾囊泡上皮细胞MAPK信号通路激活，提示其在多囊肾病发生、发展过程中起重要作用，MAPK信号通路有可能成为治疗多囊肾病的候选药物筛选的药物靶点。

［1］张树忠，胡以平，梅长林，等.Ⅱ型多囊肾致病基因PKD2突变的研究进展［J］.中华肾脏病杂志，2006，7：440.

［2］高晋生，杨宝学.常染色体显性遗传多囊肾病的治疗研究进展［J］.中国药理学通报，2009，25：141.

［3］阚秀芳，周 虹，杨宝学.水通道蛋白在多囊肾病小鼠肾囊泡上皮细胞的表达与调控［J］.中华肾脏病杂志，2010，26：39.

［4］Gabow PA.Polycystic kidney disease：clues to pathogenesis［J］.Kidney Int，1991，40：989.

［5］Yamaguchi T，Nagao S，Kasahara M，et al.Renal accumulation and excretion of cyclic adenosine monophosphate in a murine model of slowly progressive polycystic kidney disease［J］.Am J Kidney Dis，1997，20：703.

［6］Guay－Woodford LM.Murine models of polycystic kidney disease：molecular and therapeutic insights［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2003，285：F1034.

［7］Atala A，Freeman MR，Mandell J，et al.Juvenile cystic kidneys（jck）：a new mouse mutation which causes polycystic kidneys［J］.Kidney Int 1993，43：1081.

［8］Upadhya P，Birkenmeier EH，Birkenmeier CS，et al.Mutations in a NIMA－related kinase gene，Jck1，cause pleiotropic effects including aprogressive polycystic kidney disease in mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：217.

［9］Gao J，Zhou H，Lei T，et al.Curcumin inhibits renal cyst formation and enlargement in vitro by regulating intracellular signaling pathways［J］.European Journal of Pharmacology 2011，654：92.