PC12细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定及氧糖剥夺模型的制备

郭洪亮，徐忠信

（1.首都医科大学附属北京朝阳医院 神经内科，北京100020；2.北华大学附属第一临床医院；3.吉林大学中日联谊医院 神经内科，吉林 长春130033）

在缺血性神经疾病的研究中，由于体内环境较为复杂，从体外实验模拟体内试验的研究愈来愈受到重视，因神经元是不可再生细胞，神经元的原代培养难度较大，最终可用于实验的数量、纯度均受到一定限制。本实验采用PC12细胞是由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分离并建立起的细胞系，其在体外经NGF刺激诱导后可向交感神经元分化，最终导致PC12细胞在生理、生化方面都具有神经元样的功能，同时应用体外氧糖剥 夺 （oxygen－glucose deprivation，OGD）来模拟体内脑缺血过程，为今后进一步探讨缺血缺氧状态下对神经元的活力、凋亡、信号通路机制的研究奠定物质基础。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

大鼠PC12细胞株购自北京金紫晶生物医药技术有限公司（中国医学科学院肿瘤细胞库）。鼠神经生长因子（NGF）（Sigma公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 PC12细胞的培养、传代 将细胞悬液加入含有DMEM完全培养基，培养液2－3天更换一次。当细胞汇集至80%时进行传代接种。

1.2.2 鼠神经生长因子（NGF）诱导PC12细胞转化为神经元样细胞 PC12细胞培养1－2天，观察细胞贴壁后，用含NGF终浓度为50ng／ml的培养液进行培养。

1.2.3 PC12细胞转化为神经元的鉴定 （1）形态学观察 细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。（2）免疫细胞化学染色鉴定 PC－12细胞分别在NGF培养液中培养24小时后，用NSE免疫细胞化学染色进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个100×视野，计数，取均值，计算阳性细胞百分比，其中突起的长度超过胞体直径2倍者计为阳性，每次至少计数3个孔取平均值。

1.3 PC－12细胞氧糖剥夺模型的建立与评价

1.3.1 PC－12细胞 OGD 模型的建立 PC12细胞培养48h后，在无菌操作台吸净培养基，用缺氧缺糖DMEM培养液洗涤细胞3次，并用该液体孵育细胞，将培养板快速放入已造成缺氧环境的缺氧罐中，夹闭进气口和出气口；将缺氧罐放入37℃孵箱内开始计时；根据3h、6h、9h、12h、16h、24h将细胞随机分为6组进行评价。

1.3.2 PC－12细胞氧糖剥夺模型评价 （1）MTT法细胞存活率检测 在OGD不同时间组及对照组每孔加入10μl MTT溶液后4h，每孔加入100μl二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值并计算细胞存活率。（2）AO／EB荧光双染检测细胞凋亡 细胞爬片后，将PC－12细胞依据不同的时间点行OGD处理后，取出细胞爬片，固定，滴加AO／EB混合液10－15μl，应用荧光显微镜记录摄片。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 PC12细胞的培养

初次复苏的PC12细胞在培养基中呈悬浮状态，胞体圆形，直径10－15μm，处于游离期的细胞贴壁能力较差，易聚集成团，呈半悬浮状态；在培养瓶中培养24h后的细胞开始贴壁生长并分裂增殖，吸附期PC12细胞在培养基中多呈椭圆或多角形，倾向于聚集成团簇状；培养约72h后，细胞进入对数生长期，此时细胞快速生长和分裂，细胞折光性强，数目明显增多。见图1。

图1 处于不同生长阶段的PC12细胞

2.2 NGF诱导PC12细胞转化为神经元样细胞的培养

PC12细胞转化的神经元样细胞随培养时间的延长，细胞数量无明显增加，细胞长出的突触增粗增长，贴壁牢固；培养7d后基本无法消化传代；培养10d后细胞进入衰退期。

2.2.1 形态学观察 培养24h，可见细胞长出较短、较细的突触；培养48h，突触数量及长度增加；培养72 h，突触长度可达胞体的4－5倍，交织成网状，呈典型的神经元形态，占总数96%以上。见图2。

图2 NGF诱导PC12细胞转化为神经元不同时间形态观察

2.2.2 NSE免疫荧光细胞化学染色结果 NSE免疫荧光细胞化学染色结果显示：蓝色激发光下可见散在分布、呈星形并带有较长突起的绿色荧光区域，与背景对比明显，见图3－A；紫色激发光下，可见复染的细胞核呈蓝色荧光，见图3－B；图像融合后证实绿色荧光区域为PC12细胞转化的神经元样细胞，NSE免疫荧光染色呈强阳性表达，见图3－C。

图3 NGF诱导PC12细胞转化为神经元NSE免疫荧光细胞化学染色

2.3 PC－12细胞氧糖剥夺（OGD）模型的建立与评价

2.3.1 氧糖剥夺不同时间MTT法细胞存活率检测OGD3h细胞存活率较对照组略有降低，但无显著统计学意义，随OGD时间延长，细胞存活率逐渐下降，OGD12h后下降更为明显，OGD24h细胞存活率降至9.08%，与对照组及OGD3h组比较差异显著（P＜0.05）。各组细胞存活率见表1。

2.3.2 AO／EB荧光双染检测细胞凋亡 正常对照组细胞AO／EB染色，细胞核呈绿色荧光，见极少量的橙红色荧光，细胞核呈较规整椭圆形，染色质分布均匀，未见明显凋亡细胞；OGD3h、OGD6h橙红色荧光细胞数量较对照组略有所增加；随着OGD时程的延长，橙红色荧光细胞数量进一步增加，可见少数核形态不规则的凋亡细胞；OGD16h橙红色荧光的死亡细胞数量明显增多，绿色荧光细胞数量稀少；OGD 24h细胞多数死亡，可见核碎裂、固缩呈橙红色荧光。见图4，表2。

表1 OGD不同时间PC12细胞存活率MTT检测

图4 OGD不同时间PC12细胞AO／EB荧光染色

表2 OGD不同时间AO／EB双染细胞凋亡率检测

3 讨论

本研究于体外培养PC12细胞，应用NGF刺激诱导其向神经元分化，用于神经元氧糖剥夺模型建立。结果显示PC12细胞经NGF刺激转化的神经元样细胞具有典型的神经元形态，细胞不再增殖分裂，具有神经元特性。经特异性烯醇化酶（Neurospecific enolase，NSE）免疫细胞化学染色后，见NSE阳性神经元胞浆及突触呈绿色荧光，核呈蓝色荧光证实为神经元样细胞，为后续实验奠定了基础。

为了研究机体内的急性缺血性脑损伤机制，我们常通过建立体外神经细胞的OGD模型，来模拟机体缺血性脑损伤过程［1－3］。在体外建立可模拟机体急性缺血性脑损伤的神经元OGD模型，本研究在建立PC12细胞转化神经元OGD模型的基础上，在 OGD3h、6h、9h、12h、16h、24h应用 MTT法对细胞存活率进行了检测，结果显示随OGD时间的延长，细胞存活率逐渐由97.23%下降至9.08%（P＜0.05），提示模型建立成功，但 MTT法是以最终溶液OD值间接计算存活率，难以反应细胞凋亡情况。因此，实验同时应用细胞爬片法，应用AO／EB双染对细胞原位凋亡进行了检测。实验结果显示，在OGD12h之前，虽细胞凋亡率逐渐升高，但变化并不明显；OGD12h细胞凋亡率迅速升高至较高水平，两组实验结果相结合说明本实验采用的氧糖剥夺方法可明显造成神经细胞损伤，成功模拟体内脑缺血过程，为研究神经细胞缺血损伤提供有效、简单、实用、可靠的方法和手段。

［1］Jones PA，May GR，McLuckie JA，et al.Apoptosis is not an invariable component of in vitro models of cortical cerebral ischaemia［J］.Cell Res，2004，14（3）：241.

［2］Kaushal V，Schlichter LC.Mechanisms of microglia－mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra［J］.J Neurosci，2008，28（9）：2221.

［3］Dugan LL，Kim－Han JS.Astrocyte mitochondria in in vitro models of ischemia［J］.J Bioenerg Biomembr，2004，36（4）：317.