结核分枝杆菌抗原模拟肽纳米金生物传感器诊断结核病

孙文霞，袁仕善＊，黄昊文，谭云洪，黄绍文，张小萍

（1.湖南师范大学医学院，湖南 长沙410013；2.湖南科技大学化学化工学院，湖南 湘潭411201；3.湖南省结核病防治研究所，湖南 长沙410013）

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌感染引起的传染病，目前在全球范围内疫情非常严重，早期诊断和治疗是有效控制TB的重要途径。免疫学诊断是目前诊断结核病的常用方法，免疫学诊断的抗原主要有菌体蛋白、菌糖脂抗原、菌抗原模拟肽等；检测方法主要有酶免法。该方法简单快速，价格低廉，但需要酶标二抗和底物。表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术是一种新型高灵敏度的生物传感技术，可直接、实时、原位、在线监测生物分子间的相互作用，无需任何标记，样品用量少，可连续监测结合和解离过程，并可以进行多组分复合物的相互作用研究［1，2］。纳米金生物传感器是一种基于纳米金局域表面等离子体共振（Localized surface plasmon resonance，LSPR）的非标记生物传感器，这类传感器以纳米金单层作为界面固定抗原／抗体，具有非特异性吸附小、传感器能反复再生等优点，非常适于抗原－抗体相互作用的研究［3，4］。本研究旨在纳米金生物传感技术的基础上，以结核分枝杆菌模拟肽为抗原，建立纳米金生物传感器，为结核病的诊断提供新的理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

硼氢化钠（NaBH4）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、抗 坏 血 酸 硝 酸 银 （AgNO3）、氯 金 酸（AuCl3）均购于国药集团化学试剂有限公司，十一巯基十一烷酸（MUA）购于美国Sigma公司，N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）购于上海晶纯试剂有限公司，均为分析纯；结核分枝杆菌抗原模拟短肽T1由上海生工生物工程公司合成；结核患者血清由湖南省结核病防治研究所检验科提供，均为抗酸杆菌痰涂片阳性、血清抗结核抗体阳性的患者；正常人血清由湖南省人民医院检验科提供，为健康体检无异常者。

1.2 方法

1.2.1 结核分枝杆菌抗原模拟肽的合成 以纯化的结核患者血清IgG为靶分子，从噬菌体随机12肽库中免疫筛选出能与结核患者血清IgG特异性结合的噬菌体，噬菌体克隆DNA经测序分析获得结核杆菌抗原模拟肽核酸序列，推导出其氨基酸序列为ILAMRYDTTLKY。委托上海生工生物工程公司按此序列合成模拟短肽，记为T1。

1.2.2 纳米金种子溶液的制备 在室温（20－25℃）条件下，向10ml 0.1mol／L CTAB溶液中加入0.24ml 1%AuCl3溶液，搅拌并加入5ml双蒸水，缓慢加入冷藏的0.01mol／L NaBH4溶液，观察溶液颜色变化：黄色→无色→浅棕色，继续搅拌2－4 min，即得纳米金种子溶液。制好的种子溶液于25℃环境中静置2h以上备用。

1.2.3 金纳米棒的制备 在室温（20－25℃）条件下，向30ml 0.1mol／L CTAB溶液中依次加入0.8 ml 0.01mol／L AgNO3溶液和1.5ml 1%AuCl3溶液，经搅拌溶液迅速变为红棕色。逐滴加入0.1 mol／L抗坏血酸溶液直至溶液刚好褪色，继续搅拌4－5min即得纳米棒的成长液。向成长液中加入70μl纳米金种子溶液，继续搅拌2min，将溶液静置于25℃环境中，观察颜色变化。待颜色不再变化稳定后，用紫外可见分光光度计进行光谱扫描。扫描波长为1 100－400nm，双蒸水调基线，观察金纳米棒的特征吸收峰：纵向等离子体吸收峰（longitudinal plasmon peak，LPP，一般由纳米棒粒子的纵横比决定）和横向等离子体吸收峰（transverse plasmon peak，TPP）的位置，记录为LPW和TPW。

1.2.4 金纳米棒的活化 在室温（20－25℃）条件下，取6ml金纳米棒溶液，加入1.2ml 0.005mol／L MUA溶液，混匀密封，于27－30℃环境下静置12h。14 000r／min离心10min，除去上层清液，用0.01mol／L CTAB溶液分散，摇匀。分散的金纳米棒溶液中加入EDC至终浓度为75mmol／L，充分混匀。加入NHS至终浓度为15mmol／L，充分混匀。室温下活化40min。8 000r／min离心10min，除去上层清液，用双蒸水分散，摇匀。紫外可见分光光度计进行光谱扫描，观察金纳米棒溶液的LPW和TPW，并记录数据。

1.2.5 金纳米棒与抗原的作用 在室温（20－25℃）条件下，每6ml活化后的金纳米棒溶液加入50 μl 0.4mg／ml的合成短肽T1。将接入抗原的金纳米棒溶液于25℃的恒温箱中静置1h，让其充分反应。1h后将该溶液用紫外可见分光光度计进行检测，观察溶液的LPW和TPW，记录数据。

1.2.6 血清学分析 接上合成短肽T1的金纳米棒溶液即为构建好的纳米金生物传感器，室温（20－25℃）条件下，将纳米金生物传感器按2ml每份分装。将结核病人血清样品和正常人血清样品用双蒸水稀释100倍。往分装的2ml纳米金生物传感器中加入20μl稀释后的血清，此时血清最终反应浓度为104倍稀释，静置于恒温箱中作用2min左右。紫外可见分光光度计检测反应后的金纳米棒溶液，观察其LPW和TPW，记录数据，以病人／正常人红移值（P／N）≧2.0判定为阳性，并计算敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、诊断效率。

1.2.7 仪器表征 可见近红外光谱（Vis－NIR spectroscopy）在紫外可见分光光度计上检测，以双蒸水为基准，光谱扫描范围为1100－400nm。

2 结果

2.1 金纳米棒的制备

金纳米棒溶液制好后，紫外可见分光光度计进行光谱扫描，图1为其 Vis－NIR吸收光谱图，由Vis－NIR吸收光谱图可知，约520nm处的吸收峰为金纳米棒的横向等离子体峰TPP，730nm附近的吸收峰是纵向等离子体峰LPP。

2.2 纳米金传感器的构建

制备好的金纳米棒与合成短肽结合，图2为金纳米棒修饰抗原前后的Vis－NIR吸收光谱图。其LPW从760nm转变为768nm，LPP的波长位置发生了8nm的红移。抗原修饰成功后即为可用的纳米金生物传感器。

2.3 纳米金生物传感器诊断结核病

将纳米金生物传感器分别与结核病人血清、正常人血清反应，图3为反应前后Vis－NIR吸收光谱图。a为完成表面修饰的金纳米棒，其LPW为804 nm；b为与结核病人血清作用的金纳米棒，其LPW为815nm；c为与正常人血清作用的金纳米棒，其LPW为807nm。可知T1－Au NRs检测结核病人血清时其LPW红移了11nm，检测正常血清时LPW只红移3nm。这与抗原－抗体的特异性反应 效果是一致的。

图1 金纳米棒的Vis－NIR吸收光谱图

图2 金纳米棒表面抗原修饰前后的Vis－NIR吸收光谱图

图3 T1－Au NRs与血清反应的Vis－NIR吸收光谱图

用T1－Au NRs对56份结核病人血清和56份正常人血清进行检测，参与检测的病人血清中，大部分反应发生了5－20nm的红移。按P／N≧2.0判定为阳性，对病人血清的检出率为57.1%，而对正常人血清亦有16.1%的阳性率，经检验，阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05）。计算得敏感性为57.1%，特异性为83.9%，阳性预测值为78.0%，阴性预测值为66.2%，诊断效率为70.5%。结果见图4和表1。

图4 T1－Au NRs的血清学分析

表1 T1－Au NRs诊断结核病

3 讨论

金纳米棒是一种金圆柱体的棒状物，因其直径大约为10－20nm，长度约为40－200nm而得名。金纳米棒的合成方法很多，如模板法［5，6］、电化学法［7］和种子生长法［8－12］等。Nikoobakht等改进了种子生长法，使金纳米棒的产率高达99%［10］。后来，Murphy等报道了一种合成不同形状和尺寸的金纳米颗粒的方法［11］。本研究在Nikoobakht种子生长法的基础上对部分实验参数进行了修改，制备合成了分散性好、产率高的金纳米棒。

LSPR是一种由入射光（电磁场）与金属纳米粒子表面自由电子间相互作用产生的物理光学现象，入射光激发金属粒子表面自由电子发生集体振荡，当入射光频率与自由电子集体振荡频率相等时达到共振，并在紫外－可见吸收光谱中表现出特征吸收峰［13］。这种共振频率与电子密度、粒子大小和形状等密切相关。对于金纳米棒，因为电子在长轴和短轴方向的振荡频率显然有所差异，从而表现出两种不同共振频率，即纵向和横向表面等离子共振，在Vis－NIR图谱上则表现为沿纵向长度方向激发所引起的纵向等离子体峰（LPP）和沿横向宽度方向激发所引起的横向等离子体峰（TPP）。已证明Vis－NIR吸收光谱图的改变很大程度上取决于纳米粒子的形状和其所处的环境［14－17］。对金纳米棒进行光学检测，经其吸光光谱图发现，TPP的波长（TPW）随横向宽度的变化不太明显，而LPP的波长（LPW）会随着纳米棒纵横比的变化而呈较明显的变化，即不同纵横比的纳米棒对应着不同的纵向等离子体。因此，当金纳米棒上结合了活化剂等分子时，纳米棒的纵横比会发生改变，从而引起LPW发生改变，由此可以根据LPW的改变来观察金纳米棒的修饰及抗原抗体的结合作用。

Kah等［18］证明基于金纳米棒的SPR技术可以对普通癌症进行早期诊断。Sironi等［19］将抗－p53抗体结合到金纳米棒，并与异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）结合构建SPR传感器，对p53的检测浓度为200－400pmol／L。Lee等［20］将抗β3－淀粉样蛋白（1－40）抗体包被到金纳米粒子形成免疫复合物，建立的SPR传感器成功用于β3－淀粉样蛋白（1－40）的检测，有利于阿尔茨海默氏症的早期发现。虽然该技术已经在多种疾病的诊断方面获得应用，但目前其在结核病诊断中的应用还比较罕见。诊断试验的评价指标包括灵敏度、特异性、预测值及诊断效率，理想的试验应能使任何一个病人都表现出阳性结果，任何一个健康者都表现为阴性结果，但实际上这种理想试验结果是不存在的。本文利用合成肽T1构建纳米金生物传感器，对112例血清样品分别进行了血清学检测分析，并计算了各项评价指标。结果显示，T1－Au NRs对结核病人血清的诊断阳性率为57.1%，特异性为83.9%，对结核病有着较好的诊断价值。T1－Au NRs对正常人血清也有一定的阳性反应，但经SPSS17.0统计软件分析比较阳性率，发现差异是有统计学意义的。纳米金生物传感器用做诊断有着简便、快速的优势，检测一个血清样品仅需2min，且多个样品可同时检测，最大的优点便在于不需要标记抗体，省去了繁琐的洗涤步骤。

总之，本实验对一种基于LSPR的、快速简单且价廉的诊断结核病的新方法进行了探索研究。经过MUA、EDC和NHS的化学修饰，我们将合成肽结合到了Au NRs上，成功获得了T1－Au NRs，血清学分析证明T1－Au NRs对结核病有较理想的诊断价值，相信这种传感器将会成为结核病诊断的有用技术。

［1］Ho－Seong CHO，Nam－Yong PARK.Serodiagnostic Comparison between Two Methods，ELISA and Surface Plasmon Resonance for the Detection of Antibodies of Classical Swine Fever［J］.Vet Med Sci，2006，68（12）：1327.

［2］Mazumdar SD，Barlen B，Kramer T，et al.A rapid serological assay for prediction of Salmonella infection status in slaughter pigs using surface plasmon resonance［J］.Microbiol Methods，2008，75（3）：545.

［3］杨 霞，袁 若，柴雅琴，等.基于纳米金／功能化壳聚糖生物复合膜修饰的癌胚抗原免疫传感器的研究［J］.西南大学学报（自然科学版），2008，30（7）：56.

［4］Lin TJ，Huang KT，Liu CY.Determination of Organophosphorous Pesticides by a Novel Biosensor Based on Localized Surface Plasmon Resonance［J］.Biosens Bioelectron，2006，22（4）：513.

［5］Pileni MP，Ninham BW，Krzywicki TG，et al.Direct relationship between shape and size of template and synthesis of copper metal particles［J］.Adv Mater，1999，11（6）：1358.

［6］van der Zande BMI，Bohmer MR，Fokkink LGJ，et al.Colloidal dispersions of gold rods：synthesis and optical properties［J］.Langmuir，2000，16（2）：451.

［7］Zhou ZY，Tian N，Huang ZZ，et al.Nanoparticle catalysts with high energy surfaces and enhanced activity synthesized by electrochemical method［J］.Faraday Discuss，2008，140：81.

［8］Jana NR，Gearheart L，Murphy CJ.Wet chemical synthesis of high aspect ratio cylindrical gold nanorods［J］.Physical Chemistry B，2001，105（19）：4065.

［9］Jana NR，Gearheart L，Murphy C.Seed－Mediated Growth Approach for Shape－Controlled Synthesis of Spheroidal and Rod－like Gold Nanoparticles Using a Surfactant Template［J］.Advanced Materials，2001，13（18）：1389.

［10］Nikoobakht B，El－Sayed MA.Preparation and Growth Mechanism of Gold Nanorods（NRs）Using Seed－Mediated Growth Method［J］.Chem Mater，2003，15（10）：1957.

［11］Sau TK，Murphy CJ.Room temperature，high－yield synthesis of multiple shapes of gold nanoparticles in aqueous solution［J］.Am Chem Soc，2004，126（28）：8648.

［12］Batzill M，Koel BE.Silver of Pt（100）－room temperature growth and high temperature alloying［J］.Surf Sci，2004，553：50.

［13］Willets KA，Van Duyne RP.Localized surface plasmon resonance spectroscopy and sensing［J］.Annu Rev Phys Chem，2007，58：267.

［14］Kelly KL，Coronado E，Zhao LL，et al.The Optical Properties of Metal Nanoparticles：The influence of size，shape，and dielectric environment［J］.Phys Chem B，2003，107（3）：668.

［15］Lal S，Link S，Halas NJ.Nano－optics from sensing to waveguiding［J］.Nat Photonics，2007，1（11）：641.

［16］Murray W，Barnes W.Plasmonic materials［J］.Adv Mater，2007，19（22）：3771.

［17］Myroshnychenko V，Rodríguez－Fernández J，Pastoriza－Santos I，et al.Modelling the Optical Response of Gold Nanoparticles［J］.Chem Soc Rev，2008，37（9）：1792.

［18］Kah JC，Kho KW，Lee CG，et al.Early diagnosis of oral cancer based on the surface plasmon resonance of gold nanoparticles［J］.Int Nanomedicine，2007，2（4）：785.

［19］Sironi L，Freddi S，D＇Alfonso L，et al.P53detection by fluorescence lifetime on a hybrid fluorescein isothiocyanate gold nanosensor［J］.Biomed Nanotechnol，2009，5（6）：683.

［20］Lee JH，Kang DY，Lee T，et al.Signal enhancement of surface plasmon resonance based immunosensor using gold nanoparticleantibody complex for beta－amyloid（1－40）detection［J］.Nanosci Nanotechnol，2009，9（12）：7155.