乙酰胆碱调控缺氧诱导Connexin43磷酸化表达

黄柳桓，张亚南，康熙雄

（1.首都医科大学石景山教学医院·北京市石景山医院 胸外科，北京100043；2.首都医科大学附属北京天坛医院 检验科，北京100050）

心脏疾病诸如心肌梗死、慢性心衰和心肌肥大与心肌细胞的细胞偶联改变相关。缝隙连接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是心室电偶联的主要蛋白，动物试验证明Cx43基因突变小鼠虽然有正常心脏结构和收缩功能，但2个月内容易因自发性室性心律失常而死于心源性猝死［1］。缺血／再灌注损伤机制的研究发现因缺血诱导的细胞脱偶联和Cx43去磷酸化，使Cx43从缝隙连接转移进入细胞池而改变细胞间通讯信号［2，3］。Cx43含量、分布及其磷酸化的改变和异常表达导致心肌细胞功能阻滞，形成阵发性室性心动过速［4］。

乙酰胆碱（ACh）是内皮依赖性血管扩张剂，药理作用是模拟缺血预处理，使心脏在随后出现的缺血环境下抵御梗死、预防梗死、防止冠状动脉阻塞或心脏病发作［5］。ACh通过上调 TNF receptor－2和下调 TNF receptor－1［6］、抑制缺氧诱发细胞凋亡［7］抵御缺血等多种途径保护心脏，然而在缺氧条件下ACh增加Cx43磷酸化保护心脏的作用机制仍不清。我们曾报导ACh可抑制缺氧引起Cx43表达降低并恢复Cx43功能［8］，本文继续讨论在缺氧条件下H9c2细胞Cx43磷酸化动态变化及ACh诱导Cx43分布改变。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和药物制剂

用含有10%胎牛血清（Sigma）、青霉素（100IU）、链霉素（100μg／ml）的 DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）（Sigma）培养液培养H9c2细胞，置于5%CO2、37℃培养箱。ACh（Sigma，1mM）预处理 H9c2细胞1小时，随后置于37℃、5%CO2，10%H2和85%N2的缺氧环境1小时。一氧化氮合成酶抑制剂N－硝基－L－精氨酸甲酯（N－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME）（Sigma，1mM）与ACh共同处理细胞1小时，随后缺氧1小时。PKC抑制剂白屈菜赤碱（chelerythrine）（Sigma，5μM），ATP敏感钾通道阻滞剂格列本脲（Glybenclamide）（Sigma，10μM），K－ATP 激动剂二氮嗪（Diazoxide）（Sigma，100μM）进行相同试验。缺血预处理是缺氧环境5min，随后正常氧环境5 min，反复3个循环周期。

1.2 免疫印迹

在相应动态时间内提取细胞蛋白备用免疫印迹［8］。细 胞 裂 解 液 ［50mM Tris－HCl（pH6.8），10% （wt／vol）十二烷基硫酸钠，12% （vol／vol）二巯基乙醇，0.1% （vol／vol）溴酚蓝（BPB），20%（wt／vol）甘油］裂解细胞，离心收集上清，进行10%聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate－polyacrylamid gel electrophoresis，SDS－PAGE））电泳，转移蛋白到硝酸纤维膜上，第一抗体采用抗Cx43抗体（1∶1 000，Zymed），第二抗体采用抗兔IgG 抗体（1／1 000，BD），ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（Amersham Biosciences）显像分析。а－tubulin做对照，定量蛋白带密度用Bldis软件处理。

1.3 免疫组织化学

H9c2细胞用含4%多聚甲醛PBS室温固定，0.1%Triton X－100的PBS处理细胞，5%脱脂牛乳孵育过夜，抗Cx43抗体（Zymed）孵育4℃过夜，Cy3标记第二抗体（（Jackson ImmunoReserch）孵育4℃过夜。肌动蛋白用FITC标记FITC－conjugated phalloidin做背景对照。

1.4 统计学

2 结果

2.1 缺氧诱导Cx43磷酸化

Cx43有两种形式，磷酸化Cx43（P－Cx43）和非磷酸化 Cx43（NP－Cx43）（图 1）。我们曾报道［8］H9c2细胞暴露在缺氧环境中，随着时间延长0、30、60min的P－Cx43和NP－Cx43呈现渐进性减少，60 min呈现显著抑制 （P＜0.001vs 0min of hypoxia）。但是120min、240min呈现逐渐恢复，与60 min比较，虽然240min P－Cx43逐渐恢复（P＜0.001vs 60min of hypoxia），但是仍低于0min PCx43（P＜0.001vs 0min of hypoxia）。结果提示缺氧造成Cx43磷酸化的急速降低，随后逐渐恢复。

图1 Western blot检测H9c2细胞在缺氧环境下不同时间点的Cx43表达

2.2 ACh诱导Cx43磷酸化

为验证ACh是否调控Cx43磷酸化，我们用ACh处理H9c2细胞，Cx43磷酸化迅速升高持续至10min（P＜0.001vs 0min）（图2），随后逐渐降低（P＜0.001vs 10min）（图2），峰值5min。

2.3 ACh抑制缺氧诱导Cx43降低

为了解在缺氧条件下ACh是否调控Cx43，用ACh预处理细胞1小时，随后缺氧1小时，ACh抑制缺氧条件下Cx43磷酸化降低 （P＜0.001vs hypoxia）（图3）。同样结果观察在具有减少心肌坏死和保护心脏作用的缺血预处理的Cx43（图3）。

图2 Western blot检测H9c2细胞在正常氧环境下ACh诱导不同时间点的Cx43表达

图3 Western blot检测H9c2细胞在缺氧环境下不同调控方法的Cx43表达

进一步用免疫组化证实ACh调控Cx43。正常氧环境下可见Cx43表达，缺氧引起Cx43表达降低，然而ACh恢复缺氧诱导降低的Cx43表达。结合免疫印迹结果ACh抑制缺氧诱导Cx43磷酸化降低，恢复／激活Cx43功能。

2.4 ACh通过NO、ATP、KPC介导缺氧诱导Cx43磷酸化

为了解ACh诱导Cx43信号通路，我们研究化学药物是否诱导Cx43表达（图4）。在缺氧条件下，L－NAME抑制Cx43升高 （P＜0.001vs ACh＋hypoxia），同样结果观察在 Diazoxide（P＜0.05vs ACh ＋ hypoxia），而 Chelerythrine 和 Glybenclamide没有呈现抑制作用。

3 讨论

图4 Western blot检测H9c2细胞在缺氧环境下不同化学药物调控Cx43表达

慢性缺血性心脏疾病与缝隙连接蛋白功能失调相关。缝隙连接生理功能依赖于组成缝隙连接通道的开放和关闭，而这种通道开放和关闭取决于连接蛋白，Cx43与其它细胞间分子ZO－1和钙黏蛋白共同调控心肌细胞［9，10］。Cx43磷酸化便于缝隙连接通道形成、开放和Cx43非磷酸化转换［11］，丝氨酸368、325、328和（或）330磷酸化在缺血早期可以影响通 道 选 择 通 透 性 和 调 控 缝 隙 连 接 功 能［12，13］。Cx43磷酸化定位于闰盘，当心脏缺氧时Cx43在闰盘发生去磷酸化，重新在质膜分布［14］。本研究证明在缺氧条件下Cx43磷酸化和非磷酸化有显著降低（图5），提示缺氧激发缝隙连接蛋白改变。Beardslee等报道缺氧诱导的解偶联与Cx43去磷酸化相关，在缝隙连接内Cx43非磷酸化集聚，Cx43从缝隙连接迁移到细胞池［3］，而本研究未发现Cx43非磷酸化积聚（图5）。

图5 缺氧环境下不同时间点的Cx43表达水平比较分析

虽然大量文献报道Cx43在SDS－PAGE 44－46 kDa和41kDa分别表现Cx43磷酸化和非磷酸化异构体，但并没有清晰证据证明哪个Cx43特异磷酸－氨基酸残基和Cx43磷酸异构体多样性与心脏疾病相关，推测Cx43磷酸异构体多样性的可能原因是单克隆抗体能够检测迁移在SDS－PAGE分子量44－46kDa附近的几种Cx43磷酸化异构体［4］。

为进一步了解ACh诱导Cx43磷酸化机制，我们选择不同化学药物NO抑制剂、蛋白酶C抑制剂、ATP激活剂和阻滞剂诱导和分析Cx43表达探讨ACh调控Cx43通路机制。NO主要生理功能是与可溶性鸟苷酸环化酶结合增加cGMP产生，cGMP调控多种信号通路激活蛋白酶C或cAMP保护心脏。在缺血再灌注中PKC抑制剂增加预处理效果减少梗死面积、减轻收缩功能障碍和心律失常。Diazoxide通过抑制线粒体ATP合成酶［15］、激活钾通道而保护心脏作用［16］。本研究证明NO和ATP钾离子通路参与ACh上调Cx43表达的作用机制。

短暂的心肌缺血可增加心脏对随后缺氧的耐受力，这种现象称为缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）。IP是一种心肌保护措施，可显著降低心肌坏死和心肌缺血／再灌注损伤。本研究证明在缺氧条件下ACh调控Cx43蛋白具有与IP相同保护效果（图3），可能的机制是Cx43羧基末端结构参与分子内和分子间相互作用调控缝隙连接［17］，ACh激活Cx43重新分布［18，19］，上调缺氧抑制的Cx43磷酸化表达，维持Cx43的磷酸化水平，高浓度Cx43磷酸化关闭缝隙连接通道作用，从而降低心肌细胞离子超载而发挥处于缺氧条件下心肌保护作用。ACh抑制缺氧引起Cx43磷酸化的降低仍有待进一步研究，可以肯定ACh诱导Cx43的心脏保护作用不是一个因子而是多个因子共同参与综合作用的结果。Cx43异常表达影响心室肌细胞间电偶联的稳定，导致功能阻滞，诱发心律不齐［20］，因冠状动脉粥样硬化性狭窄而诱发急性心肌缺血是临床心性猝死最常见原因之一，Cx43磷酸化改变是心肌缺血／缺氧引起心肌损伤的早期征兆，为进一步研究心脏疾病的诊断、治疗和监测提供可能；ACh作为激活因子激活内源性心脏保护的信号通路，为今后药物的研究和开发提供可能。

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