灵发素（LFS）对诱导半夏体细胞胚胎发生过程中一些生化指标的影响

梁琼月 何 冰 周凤珏 解云英 陈汝贤 许鸿章 许鸿源▲

1.广西大学农学院，广西南宁 530004；2.中国医学科学院 中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京 100089

灵发素（LFS）对诱导半夏体细胞胚胎发生过程中一些生化指标的影响

梁琼月1何 冰1周凤珏1解云英2陈汝贤2许鸿章2许鸿源1▲

1.广西大学农学院，广西南宁 530004；2.中国医学科学院 中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京 100089

目的 探索LFS高效优质诱导半夏体细胞胚胎发生的机制。方法 以半夏无菌苗叶柄切段作外植体，MS为基本培养基，比较MS+BA2，0+NAA0.1（CK）和MS+LFS 0.3在诱导体细胞胚胎发生和发育过程中一些生化指标的变化差异。结果 （1）LFS显著提高体细胞胚胎发生发育过程中可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉等的含量，为增殖更多更壮的体胚提供物质保障。（2）LFS还显著提高SOD、POD和PPO三种抗氧化酶的活性，以利及时清除旺盛代谢产生的自由基，为体细胞胚胎的发生发育创造良好的内环境。结论 LFS能高效优质地诱导半夏体胚的发生发育，与其显著提高可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉的含量及提高抗氧化酶的活性密切相关。

半夏；灵发素；体细胞胚胎

半夏Pinellia ternata（Thunb） Briet为天南星科多年生草本植物，是重要的传统中药材和出口物资，地下块茎炮制后入药，能燥湿化痰、降逆止呕，消痞散结，生药用外治痈肿[1]。因市场需求不断增加，野生资源匮乏，对其组培快繁技术的研究便应运而生。但是，按照传统技术路线，生产程序复杂，繁殖效率不高。许鸿源等[2-4]利用LFS（Lingfasu，灵发素，代号PGR-08，亦称狭霉素）同时具有细胞分裂素（Cytokinin，CTK）和生长素（Auxin）两大类植物激素生物活性的特点，建立了简单高效生产半夏体细胞胚胎（Somatic embryo.亦称胚状体，embryoid）和组培苗的技术[5]。本文报道LFS高效率诱导半夏体细胞胚胎发生及发育的生物化学基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料

LFS为实验室自备重结晶品，纯度≥98%。半夏，经广西药用植物园钟仕强主任中药师鉴定为Pinellia ternata（Thunb）Briet。按参考文献[5]的方法，用其球茎获得无菌苗后，在超净工作台上切取2 cm左右的叶柄切段为外植体材料，备用。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制及外植体培养条件 根据许鸿源[5]优选出的LFS适宜浓度，以MS为基本培养基，配制MS+LFS 0.3 mg/L（单位下同），并根据张爱民[6]和薛建平[7]的研究结果，配制常规诱导半夏体胚的培养基MS+BA2，0+NAA0.1（CK），以便做直接对比研究。两种培养基均添加蔗糖30 g/L，琼脂4.5 g/L，调pH 5.8～6.0，常规灭菌，备用。培养条件：温度，昼/夜28/22℃（±2℃），光照1500 lx，11 h/d。共进行3批培养，每批接种50瓶，每瓶5个叶柄切段。

1.2.2 取样 在培养期间，根据外植体脱分化与再分化的不同阶段，分别采取外植体、胚性愈伤组织、早期胚和成熟胚，各适量，分别进行相关生化指标的测定。

1.2.3 生化指标测定 可溶性蛋白质含量用考马斯亮蓝法[8]测定；可溶性糖含量用蒽酮法[9]测定；淀粉含量用蒽酮法[9]测定；SOD（超氧化物歧化酶）活性用NBT光氧化还原法[10]测定；POD（过氧化物酶）活性用愈创木酚法[10]测定；PPO（多酚氧化酶）活性用邻苯二酚法[11]测定。

2 结果与分析

2.1 LFS对可溶性蛋白质含量的影响

由图1可见，无论是LFS组，还是CK组，在外植体阶段可溶性蛋白质含量都最低；胚性愈伤组织阶段可溶性蛋白质含量达最大值，几乎增加一倍多；到早期胚阶段有明显下降，但仍高于外植体阶段。而到成熟胚及幼苗阶段则又有一定的上升。这说明，外植体在脱分化形成胚性愈伤组织时，合成并累积了大量蛋白质，为进一步再分化出新的器官奠定物质基础。随着新器官（体细胞胚胎）的发生与成长，直至新个体的建成，蛋白质的合成及其向其他物质的转化会更趋复杂。但是在体细胞胚胎发育的整个过程中，LFS都使蛋白质维持在比CK组更高的水平。从而证明，LFS确实增加了培养物的蛋白质合成代谢与累积。这对高效率获得更多体细胞胚胎有重要意义。

图1 LFS对半夏体细胞胚胎发育过程中可溶性蛋白质含量的影响（柱状图上不同字母表示差异显著，P＜0.05，下同）

2.2 LFS对可溶性糖含量的影响

图2显示，在整个培养过程中，LFS组可溶性糖含量一直高于CK组。特别是在胚性愈伤组织形成阶段，两个实验组可溶性糖的含量都急剧上升至最大值，为新器官的建成准备充足的碳源与能源，以迎接新物质合成和新器官建成高潮的到来。在此阶段，LFS则使可溶性糖含量高出CK组54.6%，达极显著水平。

图2 LFS对半夏体细胞胚胎发生过程中可溶性糖含量的影响

2.3 LFS对淀粉含量的影响

图3显示，在胚性愈伤组织形成阶段，淀粉含量达最大值，随着体胚的建成和发育，与可溶性糖一样，淀粉含量也呈下降趋势。可是LFS组一直高于CK组，只是差异未达显著水平。然而在成熟胚阶段，LFS组则显著高于CK组。LFS促使成熟胚贮藏更多的淀粉，无疑是提高其质量的标志之一。结合上述，LFS促进淀粉、可溶性糖及可溶性蛋白质的大量合成和累积，可能是其能诱导外植体形成更多、更壮体细胞胚胎的内在原因之一，这些都是建成新器官的重要物质基础。只是在体细胞胚胎的成熟过程中，淀粉和可溶性糖等碳水化合物，作为推动整体代谢的能量来源和其他众多次生化合物的碳架来源，消耗得更快更多（图2，3），而蛋白质含量则相对稳定（图1）。

图3 LFS对半夏体细胞胚胎发生过程中淀粉含量的影响

2.4 LFS对SOD活性的影响

图4显示，CK组与LFS组，由外植体直到早期体胚形成，SOD活性都逐渐升高，之后随着体胚的成熟和萌发成苗，SOD活性又逐渐下降。在整个过程中，除幼苗阶段外，LFS组SOD活性均显著高于CK组。尤其是胚性愈伤组织阶段和早期胚阶段LFS组SOD活性分别高出CK组40.0%和49.4%。无疑，这对于在脱分化与再分化过程中，旺盛代谢所产生的过量超氧自由基的及时歧化非常有利，从而保证体细胞胚胎的健康发育，渐少夭折。

图4 LFS对半夏体细胞胚胎发生过程中SOD活性的影响

2.5 LFS对POD活性的影响

图5显示，在体胚的发生和发育过程中，POD的活性高峰到早期胚阶段才出现，比SOD的高峰要晚一步。这可能是SOD把大量超氧化物自由基歧化为H2O2（过氧化氢，双氧水）之后，才刺激POD活性迅速提高的缘故。无论如何，LFS组从早期胚到成熟胚，再到幼苗，POD活性都显著高于CK组，尤其是早期胚阶段竟高出56.4%。这对于把SOD产生的大量对机体仍然非常有害的H2O2及时转化为安全的H2O，以保证体细胞胚胎健康地发育和萌发成苗极其重要。

2.6 LFS对PPO活性的影响

图6显示，在体胚的发生和发育过程中，PPO活性变化与POD基本一致，高峰的出现也比SOD晚，这也可用“底物效应”来解释，有了一定量多酚自由基的累积之后，PPO活性才迅速升高。多酚自由基被转化以后，PPO活性又急剧下降。在体胚早期，LFS组PPO活性显著高于CK组，高出80%以上。考虑到SOD，POD和PPO都是机体超氧自由基防御体系中最重要的成员，所以LFS对它们活性的显著影响，具有重要的理论意义和实用价值。

图5 LFS对半夏体细胞胚胎发生过程中POD活性的影响

图6 LFS对半夏体细胞胚胎发生过程中PPO活性的影响

3 讨论

植物的体细胞胚胎是获得植物再生植株（组培苗）和人工种子，进行植物种群快速繁殖的重要材料。因此，如何高效优质地生产体细胞胚胎，已成近年来植物生物学研究的热门领域[12-13]。但是，此前所用的常规技术，都是以BA，NAA，2,4-D，等数种生长调节剂复配成多种类、多因素的诱导培养基，经过多个技术环节，才能获得体细胞胚胎，不仅生产程序复杂，而且效率不高。而LFS作为一种微生物源的新型植物生长调节剂，既具有CTK的生物活性，又具有Auxin的生物活性，因此在植物体细胞胚胎的生产中往往表现出特有的优势。近年来，用LFS配制的单一培养基，不但相继直接成功地诱导了名贵中药材三七[14-15]、半夏[5]及甘蔗[16]等植物体细胞胚胎的发生及发育，而且实现了高效优质。本研究以半夏为材料证明，LFS之所以比传统的BA和NAA等常用生长调节剂组合能更高效率地诱导体细胞胚胎发生和发育，是因为它显著地增加了可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉等构成机体的基本物质，为体胚的发生和发育提供了更强大的物质保障。同时LFS还能显著提高SOD，POD和PPO等抗氧化酶的活性，有利及时清除自由基，为体胚健康地发生和发育提供良好的内环境。

本研究证明，LFS单独诱导半夏体细胞胚胎发生和发育与BA和NAA等组合共同诱导相比，在整个过程中，可溶性蛋白质、可溶性糖及淀粉等的含量变化及抗氧化酶的活性变化之总体趋势非常相似。而且，其他研究者[17-19]在其他不同植物上，用不同调节剂的诱导组合，研究结果也都得到类似的趋势。这说明，尽管植物体细胞胚胎的发生和发育是一个极其复杂的过程，是一系列受基因调控并按顺序表达的结果，但是只要相关基因控制程序被启动，可溶性蛋白质等新器官建成所必需的物质合成及相关酶的活性，就会随之增加。这与启动相关基因控制程序的外源诱导因子之化学本质似乎无关。甚至，外源诱导因子可以是由不同化合物组成的多元体，也可以是单一化合物的单元体。因此，在诱导体细胞胚胎发生时，对外源诱导因子的选择是一项重要而复杂的工作。

4 小结

LFS能高效优质地诱导体细胞胚胎发生和发育，是因为它显著地增加了可溶性蛋白质、可溶性糖和淀粉等构成机体的基本物质，为体胚的发生和发育提供了更强大的物质保障。同时，还显著提高SOD，POD和PPO等抗氧化酶的活性，有利于及时清除自由基，为体胚健康地发生和发育提供良好的内环境。

[1] 中国医科学院药物研究所．中药志（第2册）[M]．第2版.北京：人民卫生出版社，1993：38-42.

[2] 许鸿源.狭霉素在植物学和农学上的应用[J].中华人民共和国知识产权局发明专利公报，2003，19（34）：6.

[3] 许鸿源，许鸿章，杨美纯，等.PGR-08理化性质及生物活性的研究[J]．广西植物，2003，23（5）：461-463.

[4] Xu Hong-Yuan，Xu Hong-Zhang，He Bing，et al.Lingfasu and Its Use on Plant Tissue Cuture in Vitro[M]//Zhihong Xu. “Biotechnology and Sustainable Agriculture 2006 and Beyond”.Beijing：Springer，2007：97-101.

[5] 许鸿源，梁琼月，解云英，等.用灵发素建立简单高效生产半夏胚状体与组培苗的方法 [J].种子，2010，29（9）：79-81.

[6] 张爱民，杨生玉，薛建平，等．多种因素对半夏外植体直接诱导形成试管小块茎的影响[J]．中国中药杂志，2005，30（8）：576-579.

[7] 薛建平，张爱民，盛玮，等．钾盐对半夏试管块茎诱导的影响[J]．中国中药杂志，2006，31（7）：546-548.

[8] 邹琦.植物生理学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2000：129-130.

[9] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2001：214-217.

许鸿源，男，1941 年4 月生。1964 年北京农业大学（现中国农业大学）植物生理学和生物化学专业毕业。1967 年西北农学院（现西北农林科技大学）植物生物化学研究生毕业。现为广西大学农学院教授，研究生导师，兼任中国植物生理学会第七、八、九届理事和广西植物生理学会理事长。长期从事植物生理学和生物化学方面的教学与科学研究。主持完成国内和国际合作课题近20 项；完成全国高等农业院校教材《植物生理学》的部分编写工作；在国内外发表学术论文70 余篇；已获得国家发明专利证书5 项。

Effects of LFS on some biochemical indicators during inducing somatic embryogenesis of Pinellia Ternata(Thunb) Briet

LIANG Qiongyue1HE Bing1ZHOU Fengjue1XIE Yunying2CHEN Ruxian2XU Hongzhang2XU Hongyuan1
1.Agricultural College of Guangxi University,Nanning 530005,China;2.Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Beijing 100050,China

ObjectiveTo explore the mechanism of inducing somatic embryogenesis with high efficiency and quality by LFS.MethodsTaken petiole cuttings of aseptic plantlets as explants.MS as the basic medium and contrast the difference of some biochemical indexes in process of somatic embryogenesis and development induced by MS+BA2,0+NAA0.1(CK) and MS+LFS 0.3.Results(1)LFS significantly improved the content of soluble protein，soluble sugar and starch during somatic embryogenesis and development. (2) LFS also significantly improved the activity of SOD,POD and PPO.ConclusionThere are close relationship between LFS induced the Somatic embryos occurrence and development with high efficiency and quality and it significantly increase the content of soluble protein,soluble sugar and starch.It also improve the activities of antioxidant enzymes.

Pinellia ternata Briet;Lingfasu(LFS);Somatic embryo

S-3

A

2095-0616（2012）11-09-03

国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09301002-001-018）；国家”863”专项经费（2006AA10A213）资助。

▲通讯作者

（部分参考文献略，如有需要者请与作者联系）

2012-05-25）