巨大口蘑液体发酵条件优化研究

梁大伟，朱 萍，陈静刁，马建伟，莫美华，*

(1.华南农业大学食品学院，广东广州510642; 2.海南大学食品学院，海南海口570228)

巨大口蘑液体发酵条件优化研究

梁大伟1，朱 萍2，陈静刁1，马建伟1，莫美华1，*

(1.华南农业大学食品学院，广东广州510642; 2.海南大学食品学院，海南海口570228)

通过单因素和均匀设计对巨大口蘑液体菌种发酵工艺条件进行了优化，研究结果表明，巨大口蘑液体发酵最佳条件为:装液量179mL、摇床转速165r/min、发酵温度28℃、初始pH6、接种量为4片直径1.2cm的菌丝块，干菌丝量达到0.8626g。通过实验研究，得到了巨大口蘑液体发酵的最佳条件，为今后巨大口蘑液体菌种的生产提供理论依据。

巨大口蘑，发酵，均匀设计

巨大口蘑(Tricholoma giganteum Massee) 由广东省连南县食用菌研究所陈秋来馈赠;PDA培养基(%) 马铃薯20，葡萄糖2，琼脂1.5～2，自来水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min;加富PDA固体培养基(%) 马铃薯20，葡萄糖2，蛋白胨0.1～0.3，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.15，琼脂1.5～2，自来水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min;酵母浸汁 广东环凯微生物科技有限公司;乳糖、葡萄糖、蔗糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵 分析纯，广州化学试剂厂;石膏、石灰、棉籽壳、麸皮 市售。

YX－280型手提式压力蒸汽灭菌锅 北京中西集团;WG800SL23－K6型微波炉 格兰仕公司; 101AS－3型数显电热鼓风干燥箱 东莞市吉之垄电子仪器厂;MC－EP201电磁炉 美的公司;LRH－250－Ⅱ生化培养箱 河南兄弟仪器设备有限公司; PL602－S电子天平 上海沪沁仪器设备有限公司; SW－CJ－2FD超净工作台 上海标仪仪器有限公司; HZQ－QG摇床 北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌丝培养 从母种试管中切出蚕豆大小的巨大口蘑菌丝块接种于加富PDA平板的中，在30℃培养，菌丝长满平板后待用。

1.2.2 巨大口蘑液体发酵培养 在巨大口蘑菌丝平板上用直径为1.2cm的打孔器取若干片巨大口蘑菌丝块，将菌丝块打碎并移接到250mL三角瓶液体培养基中，一定条件下摇床培养得到巨大口蘑菌丝球。

1.2.3 巨大口蘑生物量的测定 细胞干重法。将三角瓶中的菌丝体转移到100mL离心管中，除去多余培养液，加入 50～80mL蒸馏水，6000r/min离心10min，除去多余水分并加入蒸馏水充分洗涤，此步骤重复3次，将菌丝体转移到干净平皿中，并在平皿中垫一层保鲜膜，以便干燥后获取干燥菌丝，50℃真空干燥至恒重，电子天平准确称重，记录数据。

1.2.4 单因子实验确定培养温度中心点 将2片直径为1.2cm的巨大口蘑菌丝块打碎并移接到含180mL PDA液体培养基的250mL三角瓶中，摇床转速170r/min，初始pH为7，发酵周期10d，重复三次。观察不同培养温度对巨大口蘑液体发酵的生物量的影响。

1.2.5 单因子实验确定初始pH中心点 将2片直径为1.2cm的巨大口蘑菌丝块打碎并移接到含180mL PDA液体培养基的250mL三角瓶中，摇床转速为170r/min，培养温度为34℃，发酵周期为10d，重复三次，观察初始pH对巨大口蘑液体发酵的生物量的影响。

1.2.6 均匀设计法优化巨大口蘑液体发酵条件 选取4因素、6水平的均匀设计表及其使用表，根据单因子实验确定的各因素中心点安排合适的取值范围，得出参试因子水平表(表1)和发酵条件优化实验方案(表2)。按发酵条件优化实验方案安排实验，接种量统一为1片直径为1.2cm的巨大口蘑菌丝块，将菌丝块充分打碎并移接到PDA液体培养基的250mL三角瓶中，发酵周期为10d，每个水平做3个重复。发酵结束后测菌丝球干重，并以此为目标函数进行统计分析，获得巨大口蘑液体发酵的最佳工艺条件。

表1 参试因子水平表Table 1 Tested factor lever table

表2 发酵条件优化的实验方案Table 2 The experiment scheme of optimization of fermentation conditions

1.2.7 巨大口蘑液体发酵接种量的确定 根据上述优化结果，在优化后的发酵温度、初始pH、装液量、摇床转速条件下，结合单因素实验讨论不同接种量(1、2、3、4、5片)对巨大口蘑液体摇瓶发酵菌丝产量的影响。

2 结果与分析

2.1 单因子实验确定培养温度中心点

采用单因子实验法观察不同温度对巨大口蘑液体发酵生物量的影响，并利用SPSS17.0邓肯新复极差检验法(α=0.05)对不同培养温度下的菌丝体干重进行方差分析确定合适的培养温度范围，培养温度不同巨大口蘑菌丝体干重差异显著，结果见图1。结果表明，菌丝体干重逐渐增加，34℃达到最大，随后，随温度继续升高，菌丝体的重量反而下降。其中34℃与其它温度菌丝体干重差异达极显著水平，此温度下巨大口蘑生长量最大，为1.4316g/瓶。因此，将34℃确定为中心点。

图1 不同温度对巨大口蘑液体发酵的生物量的影响Fig.1 Effect of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different temperatures

2.2 单因子实验确定初始pH中心点

采用单因子实验法，观察不同初始pH对巨大口蘑液体发酵生物量的影响，并利用SPSS17.0邓肯新复极差检验法(α=0.05)对不同初始pH下的巨大口蘑菌丝体干重进行方差分析，确定合适的pH中心点，结果见图2。当初始pH为6时，巨大口蘑液体发酵的生物量达到最大值，为1.6870g/瓶，过高或过低的初始pH会使其生物量有所降低。从分析结果可知，不同pH条件下，巨大口蘑菌丝体干重差异显著。其中，pH为5、6、7与其它pH下的菌丝体干重差异达显著水平，而 pH6时巨大口蘑生长量最大，为1.6870g/瓶。因此，pH6是巨大口蘑菌丝体生长最适初始pH。

图2 不同初始pH对巨大口蘑液体发酵的生物量的影响Fig.2 Effect of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different pH

2.3 均匀设计法优化确定巨大口蘑液体发酵条件

表3 巨大口蘑液体发酵条件均匀设计实验结果Table 3 Uniform design experiment of liquid fermentation conditions of Tricholoma giganteum

均匀设计实验结果如表3，以菌丝体干重为目标函数(Y)对数据进行统计分析，所得结果用DPS V6.55进行均匀设计分析，所得回归方程为:

对回归方程进行检验，最终得出相关系数R= 0.9998，F=7.317352E+0002，显著水平p=0.0277，剩余标准差SSE=0.0099，小于0.05，达到显著水平，调整后相关系数Ra=0.9991，说明方程的可信度好。

方程中各项实验因子的回归系数和t检验结果见表4。

表4 各回归项的回归系数的t检验结果Table 4 Test results of the regression coefficient t of the return

由表4可知，方程中各回归项的显著水平均小于0.05，这说明X1(装液量)对菌丝体的干重影响较大;装液量与pH、温度与pH之间的交互作用对菌丝体干重影响均很大，全部达到极显著水平，而转速与pH之间的交互作用对菌丝体干重影响达到显著水平。

2.3.1 观察值和拟合值 表5中数据显示:观测值与拟合值接近，最大的拟合误差绝对值为0.0065，进一步说明了回归方程的准确性。

表5 样本的观察值、拟合值和拟合误差表Table 5 Observation value and fitting value fitting error table of the sample

2.3.2 数学模拟分析结果 通过数学模拟分析，能找出一个最优巨大口蘑菌丝培养条件的方案(表6)，得到的巨大口蘑最大干重为0.6475g/瓶。

2.3.3 验证实验 验证实验要对理论最优条件、组间最优条件进行比较。接种量统一为1片直径为1.2cm的巨大口蘑菌丝块，进行生长对比实验。发酵周期10d，重复3次，比较不同发酵条件对巨大口蘑液体发酵生物量的影响，结果见表7。

表6 液体培养干重最高指标时各个因素组合Table 6 Each factor combination liquid culture of dry weight maximum index

表7 不同培养基对巨大口蘑液体发酵生物量的影响(g)Table 7 Effects of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different Culture medium(g)

用DPS 8.01软件进行显著性分析，得知理论最优条件和组间最优条件这两个处理间差异显著(a= 0.05)，且理论最优条件的菌丝平均重量显著高于组间最优条件。

2.4 巨大口蘑液体发酵接种量的确定

从图3可以看出，随着接种量的增加，菌丝体干重逐渐增加，5片时达到最大。对不同接种量的菌丝体干重进行方差分析，结果表明，接种量不同巨大口蘑菌丝体干重差异显著(a=0.05)。其中，4片和5片与其它接种量菌丝体干重差异达显著水平，而4片和5片的菌丝体干重差异不显著。因此，4片和5片是巨大口蘑菌丝体生长最适接种量。考虑到经济因素，巨大口蘑生长的接种量设为4片。

图3 接种量对巨大口蘑液体发酵的生物量的影响Fig.3 Effect of biomass of Tricholoma giganteum liquid fermentation in different inoculation

3 讨论与结论

3.1 温度对菌丝体生长的影响

温度对发酵有很大的影响，它既会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，又会影响食用菌的代谢调控机制，影响发酵液的理化性质，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成［7］。培养温度过低，菌丝生长缓慢;培养温度过高，菌丝球松散、稀疏，活力降低，质量变差［8］。最适发酵温度随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变［1］。巨大口蘑是热带地区的一种大型食用菌，其子实体只发生在高温季节，一般常发生在6～8月，气温24～32℃。人工栽培时必须考虑到巨大口蘑既要高温，又要高湿，又必须通风［9］。本实验得到巨大口蘑的最适发酵温度为28℃。

上官舟建等［3］通过实验结果得出，巨大口蘑菌丝在15～35℃的范围内均能生长，其中最适生长温度为25～30℃，该区间菌丝生长最快、最旺盛;温度低于20℃或高于35℃，菌丝生长速度明显减缓，菌丝呈稀疏状，生活能力变弱;当温度低于10℃或高于40℃时菌丝不生长。肖兴等［9］通过实验得出巨大口蘑菌丝在26～34℃的范围内均能良好生长，最适生长温度为28～30℃，该温度范围内菌丝生长最快，长势最好，菌丝粗壮、浓白、致密。本实验所得数据与此相吻合。

3.2 初始pH对菌丝体生长的影响

发酵培养基的pH对食用菌生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活的重要因素。pH对稳定食用菌菌丝细胞内酸碱平衡和促进分解吸收培养基的营养物质具有很大作用，不同食用菌菌丝生长的最适pH各不相同，酶的活性与pH有很大关系，酶活在最适pH时表现为最强最大，稍高于或低于最适pH时酶活性就会下降。因而菌丝体的培养必须选择最适 pH，使其新陈代谢处于最佳状态［10－11］。

不同的初始pH导致生物量不同，其主要原因可能是pH影响酶的活性，当其太低或太高时会抑制菌体中某些酶的活性，阻碍菌体的新陈代谢。一般认为，细胞内的H+或OH－能影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能引起酶活性的改变。但培养基的H+或OH－并不是直接作用在胞内酶蛋白上，而是首先作用在胞外的弱酸(或弱碱)上，使之成为易于透过细胞膜的分子状态的弱酸(或弱碱)，它们进入细胞后，再行解离，产生H+或OH－，改变胞内原先存在的中性状态，进而影响酶的结构和活性［9］。pH还影响菌体对基质的利用速度和细胞的结构，影响菌体的生长和产物的合成。pH还影响菌体细胞膜的电荷状况，引起膜透性发生改变，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成。正是由于以上原因，导致了不同 pH产生了不同的生物量［13］。

3.3 装液量和摇床转速对液体培养条件的均匀设计结果讨论

巨大口蘑菌丝生长需要氧气，溶氧是液体发酵的一个重要工艺参数，装液量和摇床转速均可以改变培养基中溶氧量从而影响巨大口蘑液体发酵生物量。只要将装液量和摇床转速控制在合理的范围内，液体培养基的含氧量就能够保证巨大口蘑菌丝的正常生长，该均匀设计实验中装液量、摇床转速分别采用方白玉［14］和李敏等［15］的研究作为本实验的中心点。

3.4 接种量对菌丝体生长的影响

接种量的大小会影响菌丝生长的空间、吸氧量及营养的吸收，食用菌为好氧性真菌，液体培养时，主要靠吸收溶解在培养液中的氧气。当接种量过多时，菌丝之间会形成竞争，不利于菌丝体的生长。接种量过大时，液体培养过程中易形成菌丝团，使菌丝团内部通氧困难，菌丝体得率降低;同时，由于接种量过大使得单个菌丝团之间对营养的竞争加剧，不利于单个菌丝团菌丝的生长。由于巨大口蘑菌丝生长周期长，菇蕾(原基)发生量多，密集成丛，互相争夺养分，衰弱的菇蕾相继萎缩死亡，只有较健壮的原基能继续发育长大［12］。

3.5 结论

巨大口蘑液体菌丝发酵的最优条件为:装液量179mL、摇床转速 165r/min、发酵温度 28℃、初始pH6、最优接种量为4片直径为1.2cm的菌丝块。在此组合条件下进行液体发酵，菌丝体培养周期短、产量高、菌丝球均匀细小，为今后巨大口蘑液体发酵提供理论依据。

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Optimizing the fermentation conditions of Tricholoma giganteum

LIANG Da－wei1，ZHU Ping2，CHEN Jing－diao1，MA Jian－wei1，MO Mei－hua1，*
(1.College of Food Science，South China Agriculture University，Guangzhou 510642，China; 2.College of Food Science，Hai Nan University，Haikou 570228，China)

The optimization of liquid shake－flask fermentation conditions of Tricholoma giganteum was studied by single factor experiment and uniform design method.The results showed that the optimal liquid shake－flask fermentation conditions Tricholoma giganteum were as follows:volume was 179mL medium in 250mL flask，rotate speed was 165r/min，cultivation temperature was 28℃，pH was 6 and the inoculum size was 4 pieces of 1.2cm sclertium in diameter.The weight of dry mycelia achieved to 0.8626g.Through the experiment research，liquid optimal fermentation conditions of Tricholoma giganteum was obtained，theoretical basis would be provided for the future Tricholoma giganteum liquid strain production.

Tricholoma giganteum;fermentation;uniform design

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0228－04

巨大口蘑(Tricholoma giganteum Massee)，又名金福菇、洛巴口蘑、大白口蘑，其朵形优美、菌肉肥嫩、香气浓郁、味甜而鲜、风味独特、商品形状好，子实体营养丰富、味道鲜美，是一种蛋白质和多糖含量较高的优质食用菌，也是一种野生珍稀食用菌，有极高的营养价值和抗肿瘤、抗突变、抗病毒、降血脂等保健作用［1－3］。目前，巨大口蘑的生产多采用传统的固体栽培方式，栽培周期长、生物转化率低，难以满足市场需求。液体发酵巨大口蘑不受季节和原材料的影响，液体菌种培养周期短、成本低、能快速增殖菌体细胞、显著提高生产效率等，已受到人们的广泛关注，具有很好的应用前景，而巨大口蘑液体发酵方面的研究报道很少［4－6］。本文通过单因素和均匀设计对巨大口蘑液体发酵工艺条件进行了优化，旨在为巨大口蘑的进一步开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2011－07－12 *通讯联系人

梁大伟(1985－)，男，硕士研究生，研究方向:应用微生物学。

广东省科技计划项目(2011B020303007);广东省科技特派员专项项目(2010A02050700－18)。