松籽油脂肪酸组成及分布特征分析

朱雪梅，阮 霞，胡蒋宁，熊 华，邓泽元，彭海龙

(南昌大学生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330031)

松籽油脂肪酸组成及分布特征分析

朱雪梅，阮 霞，胡蒋宁*，熊 华，邓泽元，彭海龙

(南昌大学生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330031)

通过气相色谱法分析了松仁油的总脂肪酸组成及其上位置分布特点。结果表明，松仁油主要含有亚油酸(46.29%)、油酸(26.68%)和松籽油酸(13.84%)。sn2位置上的亚油酸(66.84%)和油酸(28.33%)含量高于sn1，3上的含量，但是Δ5系列多不饱和脂肪酸(Δ5－PUFA)主要分布在sn1，3位置上。Δ5－PUFA的存在和它们选择性地分布在sn1，3位等特点是包括红松籽油在内主要松属植物果实油脂的特点。松籽油主要由12种甘油三酯组成，其中含量比较多的是LLPi(24.13%)，OLL/LOL(17.87%)和LOPi(14.32%)。我们还对植物甾醇和维生素进行分析，结果显示松籽油含有141.64mg/100g的总植物甾醇和23.63mg/100g的总生育酚。

松仁油，脂肪酸组成，脂肪酸位置分布，甘油三酯，植物甾醇，生育酚

红松(Pinus koraiensis)在世界很多地都有生长，主要产区在中国东北、河北、山东、朝鲜和韩国。红松仁又名松仁、松子仁、海松子、罗松子、松果和松实等。《本草纲目》记载:“松子味甘，性温，无毒。主治:骨头节风湿，头眩，祛风湿，润五脏，充饥，逐风痹寒气，补体虚，滋润皮肤，久服轻身不老，另有润肺功能，治燥结咳嗽”［1］。红松籽富含脂肪，其含量在60%以上。现在药理实验证明松籽油有抗肥胖、调节血脂代谢、抗癌等功效［2－4］。然而国内对于松油脂肪酸成分的分析数据存在很大差异。例如胡兹苓等人的研究表明松籽油中含有37.7%的亚油酸、25%的油酸和18.2%的松油酸［5］;而牛之瑞、李小强等分析得到大约46%的亚油酸、31%的油酸和15%的α－亚麻酸［6－7］。另外，国产松籽油的脂肪酸位置组成和甘油三酯的构成并没有人进行报道。值得一提的是，除了总脂肪酸构成以外，脂肪酸位置分布和甘油三酯的构成也影响松籽油理化性质甚至生物活性的其他因素［8］。本文从验证国产松籽油脂肪酸组成的角度出发，对松籽油的成分组成进行了详细分析，其中包括总脂肪酸构成、脂肪酸位置分布、甘油三酯组成及植物甾醇和生育酚的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Supelco 37脂肪酸甲酯混合标准品、松籽油酸脂肪酸甲酯标准品、甘油三酯标准品如 POL/OPL/ LOP、OLL/LOL、LLL、PLL/LPL、OOL/OLO、PPL/PLP和OOO等标准品、植物甾醇标准品(β－谷甾醇，菜油甾醇等)、维生素E标准品(α－，γ－，和δ－生育酚)、胰脂肪酶、胆盐、CaCl2、BF3(三氟化硼)甲醇溶液、胆固醇、BHT、焦棓酸等 Sigma公司;正己烷、异辛烷、异丙醇、乙醚、氯仿、乙腈 色谱纯，Burdick Jackson公司;其他药品试剂 均为分析纯。

HP6890气相色谱仪(GC)、安捷伦－1100高效液相色谱仪 Agilent，USA;FW100型高速万能粉碎机北京科伟永兴仪器有限公司;RE－52AA型旋转蒸发器 上海申生科技仪器厂;DHG－9240型电热恒温鼓风干燥箱 江西鼎技科学仪器有限公司;HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;BS 224S型电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;索氏提取器。

1.2 实验方法

1.2.1 松籽油的提取 粉碎红松仁，然后用溶有BHT(0.2mg BHT/g松籽)的正己烷在65℃下索氏提取2h，并重复三次提取，最后旋转蒸干溶剂，将提取得到的油－20℃保存。

1.2.2 总的脂肪酸组成及位置组成分析 脂肪酸甲酯的制备:称取25mg油样，加入20μL 0.5mg/mL十七烷酸(C17∶0)甲酯的氯仿溶液为内标(IS)，加入1.5mL 0.5mol/L甲醇钠，充分混合后在 95℃反应3min，冷却，再加入2mL BF3甲醇溶液(10%)继续在95℃下反应2min，冷却至室温后，加入1mL饱和氯化钠和2mL异辛烷，提取脂肪酸甲酯经过无水硫酸钠干燥后用于气相(GC)分析。

GC分析条件:气相色谱仪(GC，HP6890)配有自动进样器和火焰离子化检测器，色谱柱为石英毛细管柱(SP－2560，100m×0.25mm×0.2μm，Supelco，PA)。柱温先保持100℃(5min)，采用程序升温以4℃/min升至220℃保持20min。载气为N2，总气体流速为52mL/min，进样口和检测器的温度为250℃和260℃。

脂肪酸位置组成分析和定量［8］:取7mg油样，加入7mL 1mol/L Tris－HCl缓冲溶液(pH 7.6)，1.75mL 0.05%的胆盐，0.7mL 2.2%的CaCl2和7.0mg胰脂肪酶，37℃水浴加热3min，剧烈振荡后加入4mL乙醚提取得到水解产物，过无水硫酸钠干燥后用氮气浓缩。最后将得到的水解产物(全部)用硅胶60 F254薄层板分离水解产物，展开剂为正己烷－乙醚－乙酸(50∶50∶1，v/v/v)。刮下sn2位单酰甘油酯后用上述方法进行甲酯化并用于气相分析。sn1，3位的脂肪酸组成可表示为:sn1，3(%)=(3T－sn2)/2，其中T为总脂肪酸，sn2为sn2位上的脂肪酸。实验重复操作2次。同总的脂肪酸一样，以分单一脂肪酸甲酯的含量以其在分析得到总脂肪酸甲酯中面积比为定量单位，类似定量方法请参照文献［8，10－11］。

1.2.3 甘油三酯种类的分析 各取5mg油样溶解在15mL氯仿中，取20μL溶液过膜，利用反相高效液相色谱(RP－HPLC)分析其甘油三酯的种类。

HPLC分析条件:安捷伦－1100高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器，色谱柱为 Nova－Pak C18柱(3.9mm×150mm，4.6μm，Milford，MA)，流动相由乙腈(A)和异丙醇/正己烷(B;2∶1，v/v)组成，流速为1mL/min，起始流动相为80%A和20%B，保持44min后，流动相比例变为54%A和46%B 10min，然后变为100%B并保持7min。

甘油三酯的种类由等价碳数判定，等价碳数(ECN)可表示为:ECN=CN(总碳数)－2DB(双键数)。在RP－HPLC分析条件中，甘油三酯保留时间与等价碳数一致，即等价碳数少的甘油三酯保留时间短，反之亦然［9］。所有甘油三酯的定性除了根据等价碳数和已知的甘油三酯标准品外，并且参考其他裸子植物油的甘油三酯的相关分析报道［9］。

1.2.4 植物甾醇含量的测定 准确称量25mg样品，加入50μL 1mg/mL的5－胆固醇－正己烷溶液(5－胆固醇作为内标)，再加入2mL的2mol KOH乙醇溶液，在90℃下皂化15min。取出后冰水冷却，加入1mL蒸馏水然后加入1mL正己烷充分混合后提取上层，并重复提取2次。得到的上层液用Na2SO4脱水后再用氮气吹干。得到的残留物加入50μL TMS(三甲基硅)甲醇溶液在60℃下甲酯化30min，然后用气相色谱进行分析。分析条件完全参考Zhu等的方法［10］。

1.2.5 生育酚含量的测定 称取1g油样，加入5mL含有6%的焦棓酸乙醇溶液和1.25mL 60%的KOH溶液，在70℃下皂化30min。取出后用冰水冷却至室温后，加入5mL 2%的NaCl溶液，用含有0.05%的乙醚－乙酸乙酯混合液(85∶15;V/V)提取液重复提取三次。收集得到的上层液用Na2SO4脱水后再用氮气吹干。得到的残留物用正己烷充分溶解并进行液相分析。所有的分析都重复3次。HPLC分析条件:安捷伦－1100高效液相色谱仪，紫外检测波长设为295nm，色谱柱为LiChrosorb Diol柱(3mm×100mm，5μm Chromapack，Rartian，NJ)，流动相为含有0.1%醋酸的正己烷(流速为 1mL/min)，分析时间是30min。

2 结果与分析

2.1 总脂肪酸组成

图1是松籽油的气相色谱图。如图1所示，脂肪酸碳原子数越少出峰越早，碳原子数相同的但是有双键的出现较迟，而且保留时间随双键数增加而延长，另外保留时间也受双键位置的影响。其先后出峰的顺序为C16∶0、C18∶0、Δ9－C18∶1、Δ11－C18∶1、Δ5，9－C18∶2、Δ9，12－C18∶2、C20∶0、Δ5，9，12－C18∶3、Δ11－C20∶1、Δ11，14－C20∶2、Δ5，11，14－C20∶3。由表1可见，松籽油中含量最高的是亚油酸，其次是油酸，前者含量为46.29%，后者为26.68%。本文中检测到了Δ5系列多不饱和脂肪酸(Δ5－PUFA)，主要包括松籽油酸(Δ5，9，12－C18∶3;13.84%)，Δ5－十八碳二烯酸(Δ5，9－C18∶2;2.20%)，Δ5－二十碳三烯酸(Δ5，11，14－C20∶2;0.61%)。松籽油酸是通常所指的γ－亚麻酸(Δ6，9，12－C18∶3)的异构体。本文结果与部分国内报道不一致。其中牛之瑞、陈晓强和陈雅没有检测到Δ5－PUFA，但是分别检测到了约15%的α－亚麻酸和约20%的γ－亚麻酸［6－7，12］;李林强和李建科检测了华山松籽油的脂肪酸组成，在其气相色谱图中有一个峰的保留时间在亚油酸之后，其面积相对浓度大于棕榈酸但小于油酸的峰没有进行定性［13］。但是我们的测量结果和Wolff RL报道的数据一致［11］，与胡兹苓测得的主要脂肪酸类型相似但是含量差异较大［5］。另外本文检测的国内松籽油脂肪酸的组成与韩国产松籽油相似［10］。国外大量研究结果表明，Δ5－PUFA是松属植物果仁特征性脂肪酸，所以我们推测国内没有分析检测到这类脂肪酸的主要原因是分析条件不理想和缺少Δ5－系列多不饱和脂肪酸的标准品。此外，本文还检测到其他的少量脂肪酸如棕榈酸4.62%、硬脂酸2.24%、十八碳一烯酸(Δ11－C18∶1)0.81%、花生酸(C20∶0)0.37%、二十碳一烯酸(Δ11－C20∶1)1.28%、二十碳二烯酸(Δ11，14－C20∶2)1.28%，这些分析结果也与Wolff RL等人的结果相似［11］。

表1 松籽油脂肪酸组成及其在甘油三酯中的位置分布(面积%)Table 1 The fatty acid composition and their positional distributions in triacylglycerol of pine seed oil(area%)

图1 松籽油脂肪酸组成的气相色谱图Fig.1 GC chromatogram of fatty acids in pine seed oil

2.2 脂肪酸的位置分布

表1还显示出主要的不饱和脂肪酸如油酸亚油酸在甘油三酯中sn2上的含量高于其在sn1，3位置上的含量，这个结果和普遍的植物油的脂肪酸位置分布一致，即植物油中的不饱和脂肪酸优先分布在sn2位置，而饱和脂肪酸选择性分布在甘油三酯的sn1，3位置。此分布特征有利于不饱和脂肪酸的吸收利用，因为食入的甘油三酯在胰酶作用下水解成游离脂肪酸和sn2单甘油酯，而sn2单甘油酯被优先吸收。但是值得一提的是，与其他不饱和脂肪酸相反，Δ5－PUFA选择性地分布在sn1，3位置。例如松籽油中含有13.84%的松籽油酸，其中只有1.59%分布在sn2位置，而绝大部分即19.96%的松籽油酸分布在sn1，3位置。这些结果与其它报道一致［10－11］。我们这个分析再一次证明，松属植物籽油中的Δ5系列多不饱和脂肪酸绝对性分布在甘油三酯上的sn1，3位置，这是松鼠植物籽油的又一特性。另外我们也可以推测，这个位置分布特征可能会影响Δ5－PUFA在人体内的吸收利用，不利于其生物活性的发挥。

2.3 甘油三酯的组成

图2是松籽油中甘油三酯的液相色谱图。用反相液相色谱法分离甘油三酯的主要根据是等价碳数，即等价碳数少的甘油单酯保留时间短，等价碳数大的甘油三酯保留时间长(图2)。表2列出了松子油中甘油三酯的种类及其各自含量。从表2可以看出，构成松籽油甘油三酯的等价碳数比较小，其中80%以上的甘油三酯的等价碳数≤44，这个数据也说明松籽油的融点低。松籽油中的甘油三酯成分比较复杂，主要检测出12种甘油三酯组成，其中LLPi (24.23%)的含量最高，其次是OLL/LOL(17.87%)，再次是LOPi/OLPi(14.32%)。

图2 松籽油甘油三酯的液相色谱图Fig.2 Chromatogram of triacylglycerols in pine seed oil

2.4 植物甾醇和维生素E的含量

植物甾醇有降低胆固醇吸收，进而能降低心脏病的危险［14］。而维生素不仅是植物油脂中的天然抗氧化剂，而且有调节血脂代谢、增强机体免疫力、提高抗病能力和延缓衰老的作用，因此分析植物甾醇和生育酚的含量有重要意义［15－17］。表3显示出，松籽油只含有β－谷甾醇和菜籽甾醇，含量分别是124.91、16.73mg/100g，而β－谷甾醇的含量几乎是菜籽甾醇的8倍。松籽油含有23.63mg/100g的生育酚，其中只含有 α－和 γ－生育酚且含量分别为 15.01、8.62mg/100g。

表2 松籽油的甘油三酯组成(面积%)Table 2 The triacylglycerol species of pine seed oil(area%)

表3 松籽油中植物甾醇和生育酚的含量(mg/100g)Table 3 Contents of tocopherols and phytosterols in pine seed oil(mg/100g)

3 结论

最新国际报道表明，松籽油有抗肥胖、抑制食欲、降低胆固醇、降血脂和降血压的作用。我国的松籽资源丰富，但是关于松籽油的性质研究和产品开发等研究相对较少。国内相关研究者关于松籽油脂肪酸组成的报道尚存在争议。本实验系统研究了松仁油中总脂肪酸组成，脂肪酸位置分布，甘油三酯的组成以及植物甾醇和生育酚的含量。

通过气相色谱法，我们分析验证了国产松籽油中含有相对稀有的Δ5－PUFA(17.10%)，含有Δ5－PUFA是裸子植物种子油的一个组成特征［11］。其中松籽油酸(Pi，γ－亚麻酸的同位异构体)的含量是13.84%，未能检测出部分国内研究者报道的α－亚麻酸或γ－亚麻酸［6－7］，这一检测结果与国外相关报道相符［10－11］。另外，我们通过猪胰酶水解松籽油的方法，检测了松籽油中脂肪酸在甘油三酯上的位置分布，特别值得一提的是，在总松籽油酸(13.84%)中，仅有1.59%分布在sn2位置，而19.95%分布在sn1，3位置，松籽油酸的这个分布特点与植物油中的不饱和脂肪酸不同，是包括松属在内裸子植物种子油成分组成的又一特点。

松籽油主要由12种甘油三酯组成，其中含量比较多的是LLPi(24.13%)，OLL/LOL(17.87%)和LOPi/OLPi(14.32%)。我们还对植物甾醇和维生素进行分析，结果显示松籽油含有141.64mg/100g的总植物甾醇和23.63mg/100g的总生育酚。本文的研究可以为开发松仁油在功能食品与保健用油等应用方面提供科学数据。

［1］李哲敏.松子仁的营养保健功能［J］.农牧产品开发，2001 (7):23－24.

［2］Chen SJ，Hsu CP，Li CW，et al.Pinolenic acid inhibits human breast cancer MDA－MB－231 cell metastasis in vitro［J］.Food Chemistry，2011，126(4):1708－1715.

［3］Ferramosca A，Savy V，Einerhand AWC，et al.Pinus koraiensis seed oil(PinnoThin TM)supplementation reduces body weight gain and lipid concentration in liver and plasma of mice［J］. Journal of Animal and Feed Science，2008，17(4):621－630.

［4］Lee JW，Lee KW，Lee SW，et al.Selective increase in pinolenic acid(all－cis－5，9，12－18∶3)in Korean pine nut oil by crystallization and its effect on LDL－receptor activity［J］.Lipids，2004，39(4):383－387.

［5］胡兹苓，李湘萍，包宏.松属植物种子油脂肪酸的分布及化学分类探讨［J］.植物资源与环境，1992，1(3):15－18.

［6］牛之瑞.红松仁多不饱和脂肪酸纯化及其功能研究［D］.哈尔滨:东北林业大学，2008.

［7］陈小强.红松种仁不松仁油的超临界CO2饱和脂肪酸和多糖的提取及功能检验［D］.哈尔滨:东北林业大学，2004.

［8］Zhu XM，Hu JN，Shin JA，et al.Comparison of seed oil characteristics from Korean Ginseng，Chinese Ginseng(Panax ginseng C.A.Meyer)and American Ginseng(Panax quinquefolium L.)［J］.Jouranl of Food Science and Nutrition，2010(15): 275－281.

［9］Lísa M，Hol apek M，ezanka T，et al.High－performance liquid chromatograph y－atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry and gas chromatography－flame ionization detection characterization ofΔ5－polyenoic fatty acidsin triacylglycerolsfrom conifer seed oils［J］ .Journal of Chromatography A，2007，1146:67－77.

［10］Zhu XM，Hu JN，Shin JA，et al.Enrichment of pinolenic acid at the sn－2 position of triacylglycerol molecules through lipasecatalyzed reaction［J］.International Journal of Food Science and Nutrition，2010，61(2):138－148.

［11］WolffRL，Pédronp F，PasquierE，etal.General characteristics of Pinus spp.seed fatty acid compositions，and importance of Δ5－olefinic acids in taxonomy and phylogeny of the genus［J］.Lipids，2000，35(1):1－22.

［12］陈雅，孟德胜，吴畏，等.气相色谱法测定松籽油中α－亚麻酸的含量［J］.中国药房，2006，17(5):377－378.

［13］Lin X，Ma L，Racette SB，et al.Phytosterol glycosides reduce cholesterol absorption in humans［J］.American Journal of Physiology Gastrointesttnal Liver Physiology，2009，296(4):G931－G935.

［14］李林强，李建科.华山松籽油的成分分析及其抗氧化的研究［J］.西北植物学报，2003(10):1788－1791.

［15］王福，蔡梅雪，祝寿篙.硒、维生素E对血脂及脂质过氧化作用的影响［J］.营养学报，1997，19(1):16－22.

［16］周显青，孙儒泳，牛翠娟.维生素E对免疫功能的影响［J］.生理科学进展，2000，31(2):163－165.

［17］减雪冰，胡怡秀，刘秀英，等.天然维生素E延缓衰老作用的实验研究［J］.实用预防医学，2002，9(1):32－33.

Characteristics of positional fatty acid composition and distribution in Pinus koraiensis seed oil

ZHU Xue－mei，RUAN Xia，HU Jiang－ning*，XIONG Hua，DENG Ze－yuan，PENG Hai－long
(School of Life Science and Food Engineering，State Key Lab of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330031，China)

The total and positional fatty acid composition were analyzed by GC.Linoleic(46.29%)，oleic(26.68%)，and pinolenic acid(13.84%)were the major fatty acids in pine seed oil.More linoleic(66.84%)and oleic acid (28.33%)were detected at sn2 than that at sn1，3 positions，while the most Δ5－polyunsaturated fatty acids (Δ5－PUFA)were preferentially located at sn1，3 positions.The presence of Δ5－PUFA and their positional distribution were the characteristics of the seed oils of pinus plant.Pine seed oil was composed by various of triacylglycerols，and LLPi(24.13%)，OLL/LOL(17.87%)and LOPi(14.32%)were the most abundant.Besides，141.64mg/100g of total phytosterol，and 23.63mg/100g of total tocopherols were also detected.

pine seed oil;fatty acid composition;positional fatty acid distribution;triacylglycerol;phytosterol; tocopherol

TS227

A

1002－0306(2012)10－0065－04

2011－09－01 *通讯联系人

朱雪梅(1982－)，女，博士，讲师，主要从事功能性油脂和天然产物方面的研究。

教育部博士点基金(20103601120004);江西省科技厅油脂加工与质量控制重点资助项目(赣科发2010J217);国家自然科学基金(31071561)。