固相微萃取法分析纳豆挥发性成分

黄 璇，廖卢艳，范 琳，白 亮，梁一博，蒋立文，*

(1.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙410128; 2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128; 3.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南长沙410128)

固相微萃取法分析纳豆挥发性成分

黄 璇1，廖卢艳1，范 琳2，3，白 亮1，梁一博1，蒋立文2，3，*

(1.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙410128; 2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128; 3.湖南省发酵食品工程技术研究中心，湖南长沙410128)

目的:分析纳豆中的的主要挥发性成分。方法:采用固相微萃取法提取、富集纳豆中的挥发性成分，用气相色谱－质谱法(GC－MS)对其化学成分进行鉴定，用峰面积归一化法计算各组分相对百分含量。结果:共鉴定出55种有机成分，挥发性有机物成分为47种，占总含量的80.49%，主要包括酮类、吡嗪类、醇类、酸类等15类有机挥发物。结论:纳豆挥发性成分主要为川芎嗪(26.223%)、2，5－二甲基吡嗪(23.835%)、2，3－丁二酮(15.648%)、三甲基吡嗪(13.484%)、三甲基恶唑(4.947%)、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪(2.833%)、丙酸2－羟基－1－甲基乙基酯(1.803%)、2，3，5－三甲基－6－川芎嗪(1.758%)、3－羟基－2－丁酮(1.676%)、醋酸乙烯基酯(1.377%)等。

纳豆，挥发性成分，固相微萃取，GC－MS

日本的纳豆自须见洋行分离枯草芽孢杆菌(又名纳豆菌)以来，其生理保健作用得到深入研究，特别是含有溶栓效果的纳豆激酶使其成为世界上知名的药食同源发酵大豆制品［1］，每年纳豆的市场产值达到30亿美元。目前纳豆方面的专利达到286项，在我国北京、广州、深圳等地已建立纳豆产品生产基地，产品附加值增加超过10倍以上。纳豆可以随口味来选择不同调味包食用，但其特有的氨味还不能被中国人普遍接受。随着现代控制技术的日益发展，发酵产品挥发性成分分析逐渐成为产品重要的控制指标。固相微萃取是最常用的挥发性风味物质样本采集技术，已广泛应用于环境、水、食品、香精香料及烟草等样品中挥发性和半挥发性有机物的分析，具有成本低、无需有机溶剂、所需样品量少、灵敏度高、重现性好、操作简单、方便快捷等特点［2－4］。目前在食品方面，被广泛的用作风味物质的分析检测。我国有关纳豆激酶、纳豆抗菌肽等研究非常深入，如董明盛等人对溶栓纳豆菌的筛选［5］，纳豆激酶稳定性［6］以及纳豆及其保健这方面的深入探讨［7］等，但是对纳豆气味的改良还不够深入［8］，目前还没有从风味改良的方向去解决这个问题。本文采用固相微萃取(SPME)与气相－质谱联用技术对日本纳豆中的挥发性风味成分进行了较为细致地分析，再以峰面积归一化法计算各组分在挥发性成分中的相对百分含量，为纳豆的挥发性风味物质研究提供参考，为纳豆风味改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

旭松牌“纳豆一番”纳豆 生产日期2010年4月26日，其蛋白质含量为13.6%，芽孢杆菌为5× 106cfu/g，氨基酸态氮含量为0.57%，水分为60.3%。

固相微萃取装置 包括手柄、导向杆;SPME进样器 上海安谱科学仪器有限公司;GCMS－QP2010气相色谱－质谱联用仪 日本岛津公司;GL－3250磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 固相微萃取法处理过程为:取3g纳豆研磨成样品，加6mL水，搅匀。置于15mL顶空瓶中，于磁力搅拌器上在60℃加热平衡后，通过隔垫插入已活化好的 SPME萃取头(270℃活化30min)，推出萃取头，顶空吸附40min后，插入GC进样口解析5min。

1.2.2 色谱条件 柱型采用(30m×0.25mm× 0.25μm)DB－5ms毛细管柱，柱温采用程序升温，初温40℃保持3min，然后以5℃/min升至150℃，接着以10℃/min升至250℃，保持10min，再以20℃/min升至270℃，保持1min;进样口温度250℃，采用不分流，载气He，流量为1.0mL/min。

1.2.3 质谱条件 离子源温度200℃，电离方式EI，电子能量70eV，灯丝电流150μA，扫描质量范围33～500m/z。

1.2.4 化合物的鉴定 采用计算机谱库(NIST)检索分析，定量采用峰面积归一化法求各成分相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 纳豆挥发性成分离子图谱

图1为纳豆样品的总离子流分析谱图。

图1 纳豆挥发成分的总离子流图Fig.1 The total ions count chromatogram of volatile components of natto

2.2 纳豆挥发性有机物成分及相对含量

在分析微量成分时，图谱上总会出现因方法带入的某些杂质峰。这些物质是环状的硅氧烷为主，与柱温升高有关。因此在计算风味有机化合物成分时故不予考虑［9］，所得55种挥发性物质，只有47种挥发性有机物质，其成分及相对含量见表1。

由表1可得出，各大类化合物含量及种类前6名的物质见图2。

图2 纳豆中排名前6大类挥发性有机物总含量Fig.2 The top 6 categories the total content of volatile organic compounds in natto

其中，酮类化合物有10种，含量为17.877%，酯类7种含量为3.335%，吡嗪类6种含量为68.273%，醇类5种含量为2.114%，醛类3种含量为1.109%，烷类3种含量为0.275%，胺类3种含量为0.103%，酸类2种含量为0.826%，苯2种含量为0.331%，醚类1种含量为0.135%，恶唑1种含量为4.947%，咔唑类1种含量为0.106%，哌啶1种含量为0.082%，呋喃1种含量为0.054%，肼1种有0.410%。

由表1可知，挥发性有机物中物质含量最高的为川芎嗪(26.223%)，其次分别为2，5－二甲基吡嗪(23.835%)、2，3－丁二酮(15.648%)、三甲基吡嗪(13.484%)、三甲基恶唑(4.947%)、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪(2.833%)、丙酸2－羟基－1－甲基乙基酯(1.803%)、2，3，5－三甲基－6－川芎嗪(1.758%)、3－羟基－2－丁酮(1.676%)、醋酸乙烯基酯(1.377%)等。这些物质中一些具有特别的生物功能，例如，川芎嗪［10］(2，3，5，6－四甲基吡嗪)是中药川芎中的主要活性生物碱，具有扩张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善脑缺血等多种作用;咔唑类衍生物［11］具有广泛的生物活性，如抗癌、抗微生物、抗组胺、抗氧化和抗炎等。它们气味特别，其中，2，3－丁二酮［12］又名双乙酰，在乳制品、奶油、干酪、奶酪以及许多需要奶味的非乳制品中的一种重要风味物质;吡嗪、吡唑和呋喃是美拉德反应的特征产物，具有肉品的烘烤风味;2，5－二甲基吡嗪具有坚果、马铃薯片、巧克力香味;三甲基吡嗪具有浓厚的坚果香气。值得注意的是，川芎嗪在风味口感中具有特殊异臭味;三甲基恶唑具有强的霉腐气味且口味略带苦味;2－乙基－3，6－二甲基吡嗪具有霉味。因此，纳豆特殊功效作用的物质可能主要来源包括川芎嗪、三甲基恶唑、2－乙基－3，6－二甲基吡嗪。由实验结果得出三种物质总含量达到所得挥发性有机物含量的42.54%，这可能是具有特殊氨味的纳豆重要营养成分。纳豆中主要风味物质可能是具有特殊味道的川芎嗪、三甲基恶唑以及2－乙基－3，6－二甲基吡嗪所致，三者对产品的风味贡献极大，其他含量极少物质对纳豆风味影响的具体情况还有待研究。

3 结论与讨论

本研究采用固相微萃取技术(SPME)结合GC－MS方法鉴定了日本纳豆中的47种挥发性成分，其主要成分分别为:川芎嗪、2，5－二甲基吡嗪、2，3－丁二酮、三甲基吡嗪。而Tadayoshi Tanaka［13］对纳豆的风味成分分析采用单独气谱(GC)或气相色谱－嗅探综合(GC－sniffing)测试的采集技术，单独质谱(MS)或质谱和保留系数(mass spectrum and retention index)的检测方法共检测出74种挥发性物质，但百分含量超过0.01%的只有22种，且确认了丙酮和异丁酸甲酯是其主要的风味成分，含量分别高达70.84%和13.35%，其次是乙醇(7.35%)、异丁酸乙酯(2.51%)、噻吩(0.32%)等。两方法都检测出了乙醇、醋酸乙酯、丁酸乙酯等挥发性成分，但是含量最多的物质存在较大差异，本研究中采用的SPME技术提香测定的成分吡嗪类化合物高达68.273%且酮类化合物含量只有17.87%，与日本学者的丙酮70.84%数据相差甚远，这与纳豆采用工艺不同或者检测方法不同有密切关联，说明两个挥发物提取方法的差异影响到挥发物的峰值，从而导致结果不同。

表1 纳豆中挥发性有机物化学成分Table 1 Volatile organic components in natto

本研究表明纳豆挥发性成分主要为嗪类、酮类化合物等，这些物质对纳豆挥发性成分形成的风味具有重要贡献作用，因此，研究这些物质可以为进一步确定纳豆风味成分研究提供新思路，为更好地改善纳豆风味适合更多中国人的口味提供科学依据。

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Analysis of volatile components from natto by solid－phase microextraction

HUANG Xuan1，LIAO Lu－yan1，FAN Lin2，3，BAI Liang1，LIANG Yi－bo1，JIANG Li－wen2，3，*
(1.Orient Science and Technology College of Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China; 3.Hunan Provincial Engineering and Technology Research Centre for Fermented Food，Changsha 410128，China)

Objective:To analyze the natto in the main volatile components.Methods:Solid phase micro extraction and enrichment of volatile components in natto，a gas chromatography mass spectrometry(GC－MS)and its chemical components were identified，with the peak area normalization method to calculate the relative percentage of each component sub content.Results:Identified 55 kinds of chemical composition，47 kinds of volatile organic components of the total content of 80.49%，including pyrazines，pyrroles，pyridines，thiazoles，thiophenes，furans and sulfur components，aldehydes，ketones，alcohols，acids，esters，hydroxybenzenes，hydrocarbon.Conclusion: The main volatile components natto were Tetramethyl pyrazine(26.223%)，2，5－Dimethylpyrazine(23.835%)，2，3－Butanedione(15.648%)，Trimethylpyrazine(13.484%)，trimethyl－Oxazole(4.947%)，2－Ethyl－3，6－dimethylpyrazine(2.833%)，2－hydroxy－1－methylethyl ester(1.803%)，2，3，5－Trimethyl－6－ethylpyrazine (1.758%)，3－hydroxy－2－Butanone(1.676%)，Acetic acid ethenyl ester(1.377%)and so on.

natto;volatile components;solid－phase microextraction;gas chromatography－mass spectrometry (GC－MS)

TS207.3

A

1002－0306(2012)10－0058－04

2011－07－26 *通讯联系人

黄璇(1988－)，女，硕士研究生，研究方向:食品生物技术。

湖南省教育厅项目(DFCXS201006)。