正交试验优选玄参蒸制中试工艺的研究

曹 岗，季金玉，丛晓东*，张 云，蔡宝昌，3，4*

（1.浙江中医药大学中药炮制技术研究中心，浙江 杭州 310053；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046；3.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏 南京 210029；4.南京海昌中药集团有限公司，江苏 南京 210061）

玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根，始载于《神农本草经》，玄参主要分布于东北、华北与华东地区。玄参为咸寒之品，质润多液，功能滋阴降火、解毒、利咽等，为临床常用中药。玄参主要含环烯醚萜苷类、苯丙素苷类、芳香糖苷类等，其中环烯迷萜苷类和苯丙素苷类成分的含有量都非常高［1］。《中国药典》2010年版收载蒸透或润透，文献报道，玄参炮制以直接蒸制的方法为好［2-3］，但目前采用的蒸制工艺缺乏客观可控性较强的工艺参数，质量难以得到完善系统的控制。玄参蒸制后，5-羟甲基糠醛 (5-HMF)的量较生品中明显增加。研究表明，5-羟甲基糠醛具有多种生物活性［4-5］，对玄参炮制工艺及机制的研究具有重要意义，且尚未见文献报道。

中试是在大规模产量前的较小规模试验。中试的目的是验证、复审和完善实验室工艺所研究确定的反应条件，研究选定的饮片工业化生产设备结构、材质、安装和车间布置等，为正式生产提供数据。本实验采用蒸制法炮制玄参，以哈巴俄苷、5-羟甲基糠醛和浸出物作为指标，在中试规模上，运用现代饮片工业设备，采用正交试验优选玄参最佳蒸制工艺参数，为更好地控制玄参炮制品质量提供了依据。

1 仪器及试药

Dionex UltiMate 3000型系列高效液相色谱仪(美国 Dionex公司)；KQ—250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TGL—16C高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂)；AL204电子天平；XS105分析天平 (梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司)；蒸药箱 (杭州春江自动化研究所)；往复式切药机。

乙腈、甲醇 (色谱纯)、水 (重蒸水)，其他试剂均为分析纯；哈巴俄苷对照品 (批号111730-200604)购自中国药品生物制品检定所，5-羟甲基糠醛对照品 (批号 H40807—250MG)购自 US ALDRICH chemistry。玄参药材由浙江中医药大学中药饮片厂提供，经浙江中医药大学张云主任中药师鉴定为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl的干燥根。

2 方法与结果

2.1 样品中哈巴俄苷及5-羟甲基糠醛的测定［6］

2.1.1 色谱条件 Agilent Zorbax C18色谱柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.03%磷酸水溶液 (A)-乙腈 (B)；检测波长为280 nm；柱温30℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。在该色谱条件下，5-羟甲基糠醛及哈巴俄苷与其他峰达基线分离，色谱图见图1。

图1 玄参生品、制品及混标色谱图Fig.1 Chromatograms of crude，processed Scrophulariae Radix and mixed reference substances

2.1.2 对照品贮备液的制备 分别精密称取哈巴俄苷对照品 0.204 mg和 5-羟甲基糠醛对照品0.340 mg置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取玄参样品粉末约0.5 g，加入50 mL的50%甲醇，称质量，静置1 h，超声45 min，补足损失质量，过滤，取续滤液，离心即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液1.25、5、7.5、10、12.5、15 μL依次注入液相色谱仪进行分析，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归计求得回归方程。5-羟甲基糠醛的回归方程 Y=16688.6398X+0.3185385，r=0.9999；哈巴俄苷的回归方程Y=24831.9316 X－0.0714074，r=1(n=6)；其结果表明5-羟甲基糠醛与哈巴俄苷分别在0.00425～0.05100 μg、0.00255～0.03060 μg进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取玄参供试品溶液10 μL，连续进样5次，测定各组分的峰面积值(n=5)，计算得哈巴俄苷和5-羟甲基糠醛的峰面积的RSD分别为0.51%和1.19%。

2.1.6 稳定性试验 取同一批供试品，按样品测定项下的方法制成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测定各组分的峰面积值，计算得哈巴俄苷和5-羟甲基糠醛的峰面积的RSD分别为2.35%和1.85%(n=5)。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批供试品，平行制备5份，按样品测定项下的方法操作，进样10 μL，在上述色谱条件下分别测定，求得哈巴俄苷和5-羟甲基糠醛的RSD分别为0.82%和2.84%(n=5)。实验结果表明，本法重复性良好。

2.2 炮制方法

2.2.1 生玄参的制备 取原药材，去除多余根茎，洗净，晾干，即得玄参样品。

2.2.2 蒸制玄参的制备 取生玄参45 kg，平均分成9份，按照L9(34)正交表安排，置蒸药机中蒸制，蒸透后稍晾，切薄片。

2.3 正交试验设计安排 《中国药典》2010年版收载的蒸制玄参，由于其中没有具体可量化的操作工艺参数，给生产和质量控制带来不便，因此本试验选用智能化控制蒸药机，采用正交设计来对浸泡时间、蒸制时间、干燥温度进行优选。参考文献的基础上，以浸泡时间 (A)、蒸制时间 (B)和干燥温度 (C)为考察因素，每个因素取3个水平，以哈巴俄苷、5-羟甲基糠醛的含有量及浸出物得率为指标综合进行玄参蒸制工艺的考察。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

浸出物测定按照《中国药典》2010年版附录中水浸出物测定的方法进行测定。将各样品浸出物的量和总量最高的那一项值定为100分，把各号样品的浸出物和含有量转化为分数。综合加权评分，采用正交设计助手V3.1版计算机软件分析数据，数据见表2，方差分析见表3。

表2 L9(34)正交试验结果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal test

结果显示:C因素有显著性差异，故C因素确定为3水平，即干燥温度95℃；A因素影响较小，由直观分析为3水平，即泡30 min。B因素无显著性差异，考虑到蒸制目的是便于切片，结合直观分析确定为2水平，即蒸2 h。因此，最终确定最佳中试蒸制工艺为A3B2C3。

2.4 蒸制工艺验证 按照优选出的玄参炮制工艺条件即浸泡30 min、蒸制2 h、干燥温度95℃，分别制备3批样品并测定各指标成分。所制备的玄参饮片性状好，测得样品饮片整体性状较好，所得样品浸出物得率分别为 71.29%、71.32%、71.26%，5-羟甲基糠醛含有量分别为0.195%、0.197%、0.195%，哈巴俄苷的含有量分别为0.173%、0.169%、0.170%。见表4。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 3批玄参蒸制品中5-羟甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物的测定Tab.4 Determination of 5-HMF，harpagoside and extracts in three processed products of Scrophulariae Radix

2.5 玄参炮制前后5-羟甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物测定及比较 方法同前，结果见表5。玄参蒸制后哈巴俄苷与浸出物变化不明显，但5-羟甲基糠醛的含有量剧增。

表5 玄参生品与蒸制品中5-羟甲基糠醛、哈巴俄苷及浸出物的测定Tab.5 Determination of 5-HMF，harpagoside and extracts in crude and processed products of Scrophulariae Radix

3 讨论

本实验在在进行色谱分析时，采用了几种流动相进行实验，以确定最佳流动相。实验过程中选择了多种流动相系统:甲醇-水；乙腈-水；乙腈-0.1%甲酸；乙腈-0.3%磷酸进行梯度洗脱。结果表明，甲醇在较低波长处吸收较强，梯度洗脱时基线漂移严重，而乙腈-水体系相对较好，另外在酸性条件下有较好的色谱峰分离，而故实验选取乙腈-0.3%磷酸为流动相。结果表明酸性环境有利于各色谱峰的分离，但采用乙腈-0.1%甲酸时基线漂移且噪音明显，故实验选取乙腈-0.3%磷酸为流动相。

中药指标成分在炮制加工成饮片的过程中有所损失时不可避免的，实验结果显示，优化的蒸制工艺条件对玄参中主要成分哈巴俄苷的含有量影响很小。且玄参生品中5-羟甲基糠醛含有量很低，而蒸制品中含有量显著增加。它主要是由己糖经加热分解产生，广泛存在于含有糖类物质的植物和食品中，一般在炮制或加热后其含有量会增加。5-羟甲基糠醛是玄参炮制前后含有量变化极其显著的物质，文献报道这一被认为有一定副作用的物质具有增强大鼠红细胞变形活性及抗氧化、改变血液流变学等对人体有益的作用，可能是一种曾被人们忽视的活性成分。前期研究表明它可以抗氧化、保护血管内皮细胞改善血管微循环、保护肝细胞和促进免疫系统功能，化学研究结合药理研究可推测其可能是玄参炮制增效的物质基础之一。

目前，中药材炮制工艺大多缺乏科学合理的技术参数，且实验室研究的工艺参数放大至工业生产上就会有一定的偏差，因此实验室工艺无法直接应用于工业化生产。因此，在中试规模上，采用自动化蒸药机研究玄参炮制品的工艺参数具有理论和实际应用两方面意义。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:108-109.

［2］Hou Y C，Ching H，Chao P D，et al.Effects of glucose，frutose and 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde on the presystemic metabolism and absorption of glycyrrhizin in rabbits［J］.J Pharm Pharmacol，2005，57(2):47-25.

［3］Matsuda H，Tsukioka Y，Moriyama K，et al.Studies on Rehmanniae Radix V.5-hydroxymethyl-2-furaidehude，active constituent of the steamed root of Rehmannia glutinosa having increasing activity of erythrocyte deformability in rats［J］.Nat Med，2004，58(1):34-37.

［4］张发科，吕青涛，张兆旺，等.HPLC法研究不同工艺对玄参中哈巴俄苷和肉桂酸含量的影响［J］.化学分析计量，2006，15(6):51-53.

［5］丁 霞，王明艳，余宗亮，等.山茱萸中5-羟甲基糠醛的分离鉴定及生物活性研究［J］.中国中药杂志，2008，33(4):392-395.

［6］曹 岗，季金玉，丛晓东，等.玄参蒸制不同时间5-羟甲基糠醛的含量比较［J］.中国新药杂志，2012，21(8):936-938.