九节龙皂苷衍生物对脑胶质瘤U373细胞株及裸鼠移植瘤的影响

王 荣，校 鑫，林 瑶，张 磊，王晓娟*

（1.第四军医大学口腔医学院药剂科，陕西 西安 710032；2.第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032）

皂苷是广泛存在于自然界的一类活性物质，其抗肿瘤作用一直是研究的热点。研究表明，皂苷抗肿瘤作用的靶点和途径广泛多样，有很好的研究和开发前景［1］。

九节龙皂苷 (Ardipusilloside，ADS)是本课题组最早从川产九节龙Ardisia pusilla A.DC中分离得到的具有自主知识产权的先导化合物，该化合物具有抗肿瘤作用［2-3］，特别是对脑胶质瘤具有明显的抑制作用［4-8］，可引起胶质瘤细胞凋亡，且不影响脑内正常支持细胞，具有广阔的开发前景，已获专利4项。在原有的结构基础上，对九节龙毛苷进行了一系列的结构修饰，经过MTT法筛选，九节龙皂苷修饰物ADS003较九节龙皂苷有更好的抗肿瘤效果。本实验拟观察ADS003对体外培养的脑胶质瘤U373细胞的抑制作用，从分子水平探讨其抑瘤作用机制；并通过建立裸鼠移植瘤模型，考察ADS003对瘤体以及caspase表达的影响，从体内外探讨ADS003的抑瘤作用机理。

1 材料和方法

1.1 细胞株 胶质瘤U373细胞系由第四军医大学西京医院全军神经外科研究所提供。于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素、0.37%NaHCO3、0.42%Heppes的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA(ethylenediamineetraacetic acid)消化传代。

1.2 药品、试剂及仪器 九节龙皂苷衍生物003［(ADS003)，自制，纯度＞92%］；DMEM培养基(美国Invitrogen公司)；胎牛血清 (美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑蓝 (methyl thiazolylterrazaium，MTT)(美国Sigma公司)；兔抗Caspase3、Pho-Caspase3单抗、山羊抗兔二抗 (美国Santa ctruz公司)；DAB显色液 (北京中衫公司)。

CO2培养箱 (美国Thermo公司)；空气净化台(苏州净化设备厂)；酶联仪、电泳仪 (美国Bio-Red公司)；凝胶成像系统 (美国Alpha Innotech公司)；双速恒温振荡器 (太仓市科教器材厂)；低温高速离心机 (美国Beckman公司)；pH值测定仪 (德国Sartorius公司)。

1.3 动物 成年雄性BALB/c裸鼠(6周，25 g)，购自第四军医大学实验动物中心。

2 实验方法

2.1 MTT法检测ADS003对U373细胞增殖的影响取对数生长期U373细胞，稀释成2×104/mL的单细胞悬液，接种至96孔板内，培养24 h，吸取陪养液、弃掉，加入含不同ADS003质量浓度 (2、4、8、16、32、64、100 mg/L)的培养液，培养24、48、72 h。随后每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，继续培养4 h，吸取上清、弃掉，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min。酶标分析仪检测490 nm波长的光密度值。抑制率 (%)=(A对照组－A实验组)/A对照组×100%。

2.2 流式细胞术 (flow cytometry，FCM)检测凋亡细胞 将U373细胞接种于4个100 mL培养瓶中培养24 h，将培养液换成含ADS003的培养液，继续培养24 h。消化细胞，加入含血清的完全培养基。轻微吹打使细胞脱壁，500 r/min离心5 min收集细胞，吸取上清、弃掉，用PBS洗涤细胞2次。后续步骤按照Annexin V FITC试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪定量分析细胞凋亡水平。

2.3 免疫细胞化学实验 取对数生长期U373细胞，稀释成2×104/mL的单细胞悬液，接种至放有盖玻片的6孔板内。细胞帖壁后，吸取培养液、弃掉，加入含ADS003培养液，继续培养24 h。然后用PBS清洗3次，0.3%的 H2O2封闭20 min，加入Triton-100(0.15%)破膜10 min，PBS清洗3次，加入一抗4℃过夜，加入二抗，按DAB操作步骤过缸，树胶封片。结果判读以胞浆被染成棕色判为阳性细胞。每张片子随机选择8个视野，采用image pro plus 6.0分析灰度值。

2.4 实体瘤动物模型的建立 取对数生长期的U373细胞，消化，获得单细胞悬液，检测细胞活率达95%～98%。离心沉淀细胞，生理盐水重悬，调节密度至5×107个/mL。成年雄性BALB/c裸鼠40只，碘仿消毒，每只100 μL，接种于裸鼠背部皮下，饲养于第四军医大学口腔医院实验动物中心。

2.5 实验分组及给药 接种后，待瘤块长径为10 mm左右，将成瘤的40只裸鼠随机分为阴性对照组，ADS003低、中、高剂量组 (12.5 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg)，每组10只。次日 (d1)开始给药，药物均以生理盐水稀释，灌胃给药，每3日1次，以游标卡尺分别测量瘤块长径 (a)和短径 (b)，计算体积 (v)=a×b2/2。药后15 d，处死，剥离瘤块，称质量，计算抑瘤率［9］。

2.6 免疫组织化学 取瘤块，制作蜡块，切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。用甲醇新鲜配制的0.3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，用0.01 mol/L枸橼酸缓冲液进行抗原修复。10%正常山羊血清封闭液37℃温育30 min，滴加稀释后的一抗4℃过夜，加入二抗，按DAB操作步骤过缸，树胶封片。显微镜观察并照相。

2.7 统计学分析 所得数据用SPSS13.0软件计算均数及标准差，并进行方差分析，组间差异采用Dunnett-t检验。实验数据用均值±标准差 ()表示。

3 结果

3.1 ADS003对U373细胞的细胞毒性 不同质量浓度ADS003对U373细胞生长的抑制作用如图1所示，随着ADS003质量浓度的增加，对U373细胞的抑制作用明显增强；随着药物作用时间的延长，ADS003对胶质瘤细胞的抑制作用也呈现增强趋势。

图1 不同质量浓度九节龙皂苷合成物对U373细胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibit effect on proliferation of U373 cells treated with different concentrations of ADS003

3.2 FCM实验结果 采用FCM定量分析正常对照组和ADS003处理24 h后U373细胞的凋亡率。结果如表1所示，与正常U373细胞相比，ADS003处理组随质量浓度增加U373细胞凋亡率明显增加(P ＜0.01)。

3.3 免疫细胞化学实验结果 ADS003作用24 h后，脑胶质瘤U373细胞中Caspase3、p-Caspase3均在胞浆中高表达，并随着药物质量浓度的增加，凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表达增加，与阴性对照组比较，有显著差异 (P＜0.01)。见表2。

表1 九节龙皂苷衍生物随质量浓度变化对U373细胞凋亡的影响Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

表1 九节龙皂苷衍生物随质量浓度变化对U373细胞凋亡的影响Tab.1 Effects of ADS003 on the apoptosis of U373 cells()

注:与对照组相比，*P＜0.05；与对照组相比，#P＜0.01。

组 别 质量浓度/(mg·L－1)细胞样本数/个OD值 细胞凋亡率/%阴性对照组 － 6 0.876±0.03 －ADS003高剂量组 15.0 6 0.636±0.04 61.26*#ADS003中剂量组 10.0 6 0.437±0.03 49.98*#ADS003低剂量组 5.0 6 0.177±0.03 20.24*

表2 九节龙皂苷衍生物随质量浓度变化对Caspase3、p-Caspase3的免疫细胞化学的影响Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

表2 九节龙皂苷衍生物随质量浓度变化对Caspase3、p-Caspase3的免疫细胞化学的影响Tab.2 Effects of ADS003 on Caspase3 and p-Caspase3 expression()

注:与对照组相比，*P＜0.05；与对照组相比，#P＜0.01。

阴性对照组 － 8 0.1322±0.026 0.1155±0.029 ADS003高剂量组 15.0 8 0.4778±0.018 0.5320±0.018*#ADS003中剂量组 10.0 8 0.3021±0.034 0.3196±0.031*ADS003低剂量组5.0 8 0.1418±0.012 0.1321±0.022

3.4 对裸鼠移植性实体瘤模型的抑制作用 与对照组比较，ADS003在12.5～50 mg/kg能显著抑制裸鼠荷瘤U373细胞的生长，其抑瘤率45.9%～55.8%；ADS003能显著抑制荷瘤鼠体质量的增长(P＜0.01)。见图2。

图2 不同质量浓度九节龙皂苷衍生物对裸鼠荷瘤U373细胞生长的抑制作用Fig.2 The inhibit effect on proliferation of U373 cells bearing mice with different concentrations of ADS003

3.5 ADS003对裸鼠移植性实体瘤Caspase表达的影响 肿瘤组织经DAB染色，细胞核染成淡蓝色，Caspase3、p-Caspase3位于胞浆中，被染成褐色。如图3、图4所示。不同剂量ADS003作用后，随着药物质量浓度的增加，凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表达逐渐增加。

图3 九节龙皂苷衍生物对裸鼠荷瘤U373细胞p-Caspase3表达的影响Tab.3 Effects of ADS003 on expression of Caspase3 and p-Caspase3 in U373 cells bearing mice

图4 九节龙皂苷衍生物对裸鼠荷瘤U373 Caspase3表达的影响Tab.4 EffectsofADS003onexpressionofp-Caspase3 in U373 cells bearing mice

4 讨论

通过对活性先导化合物进行结构修饰发现新的活性成分是创制新药的有效途径之一［10］。本课题所采用的ADS003即是以九节龙皂苷为先导物，对其30位醛基进行结构修饰所得的产物，前期实验结果显示，该修饰物具有明显的抗肿瘤活性。但其具体抗肿瘤分子机制还有待研究。

本研究通过体内外实验证实了ADS003对脑胶质瘤U373的抑制作用。体外培养的人脑胶质瘤U373细胞经ADS003处理后，随着药物浓度的增加胶质瘤细胞增殖受抑制的作用越明显；随着药物作用时间的延长，抑制作用增强，呈现时间和剂量依赖性。FCM实验证实ADS003可剂量依赖性的促进U373细胞凋亡，免疫细胞化学实验结果表明ADS003诱发U373细胞凋亡与其促进凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3表达有关。通过对裸鼠移植性实体瘤模型研究发现，ADS003能抑制肿瘤生长，免疫组化实验结果表明经ADS003给药后，上调了Caspase3、p-Caspase3的表达。

肿瘤的发生是多因素相互作用、极其复杂的过程，而药用植物中的活性成分可通过多种途径、多个靶点发挥其生物学作用，成为目前研究的热点和重点［11］。ADS003是九节龙皂苷的修饰物，本实验从体内外两方面证实了其抑瘤机理，ADS003能够抑制肿瘤细胞的生长，呈剂量依赖性；并能够诱发肿瘤细胞发生凋亡，这种作用机制极可能是通过上调促进凋亡蛋白Caspase3、p-Caspase3，诱发U373细胞大量凋亡，发挥重要的抗肿瘤作用。综上所述，上述研究结果为该药进一步的研究提供可靠的实验证据和立论依据。

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