温度对黄连不同炮制品中生物碱的影响研究

沈晓庆，杨彦华，张 凡，降 雪，曲胜军，贾天柱，2*

（1.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600）

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。味苦，性寒。归心、脾、胃、胆、大肠经［1］。黄连的药用始载于《神农本草经》，列为上品，能清热燥湿，泻火解毒，中医常用于主治温病热甚心烦，湿热痞满，湿热下痢等。黄连中成分主要为多种异喹啉生物碱，其中包括小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、巴马亭、药根碱等［2］。黄连药性寒凉，经性热的黄酒或性温的姜汁、吴茱萸制后，能够降低其苦寒之性，即以热制寒，是为“反制”；经苦寒的胆汁或盐制后，则更增强了黄连的苦寒之性，使寒者益寒，是为“从制”［3］。一味黄连以寒热不同的辅料炮制，即可发挥增寒和缓寒的双重作用，这就是炮制的奥秘。有报道认为生物碱为寒性药的主要成分之一，由此可以推测，胆黄连寒性增强应该与其中生物碱含有量增加有关［5］。在对黄连生品及胆汁黄连和酒黄连中主要生物碱类成分及含有量的比较研究中，发现总生物碱含有量经炮制后均有不同程度增加，酒黄连和胆黄连增加幅度接近，胆黄连各成分增加较酒黄连多［6］。但同时也有报道称，在测定黄连8种不同炮制品生物碱含有量的研究中，发现黄连的生物碱以酒制＞醋制＞姜制＞萸制＞土制＞胆制＞盐制＞碳制依次递减，结果显示胆黄连各成分较酒黄连少［7］。以上两篇文献的结论不一致，可能是由于黄连不同炮制品的炮制温度、时间及辅料加入量不同等因素造成的。由此，本实验以酒黄连和胆黄连为黄连两类炮制品的代表，在不同温度下进行炮制，以更科学地考察黄连不同炮制品中生物碱含有量差异变化，为黄连不同炮制品的药性研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC—10ATVP高效液相色谱仪 (日本岛津公司)，SPD—10AVP紫外检测器 (日本岛津公司)，METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER)，KQ—250DB型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 磷酸、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠、盐酸、甲醇均为分析纯。乙腈 (天津市大茂化学试剂厂)为色谱纯。水为纯净水。

小檗碱对照品 (中国药品生物制品检定所，批号0713-9906)，巴马汀对照品 (中国药品生物制品检定所，批号110732-200506)，盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱对照品由中国中医科学院王智民教授惠赠。黄连药材购自四川省药材公司，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为为毛茛科植物黄连Coptis chinensis的干燥根茎。黄酒 (绍兴市古泉酿酒厂，批号20100128，酒精度9%)，猪胆购自市场。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水 (45 ∶55)，内含KH2PO43.4 g/L，SDS 1.7 g/L(再以磷酸调节pH为3.0)；检测波长345 nm；体积流量1 mL/min；柱温40℃；进样量10 μL。理论塔板数按盐酸小檗碱计大于4000，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱与其他峰的分离度均大于1.5，峰形基本对称。见图1。

图1 混合对照品 (A)和60%胆汁润120℃烘干品 (B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Coptis chinensis Franch processed with 60%bile at 120℃(B)

2.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱，盐酸巴马汀、黄连碱、表小檗碱对照品适量，加甲醇-盐酸 (100∶1)溶解，制成质量浓度分别为1.3150 mg/mL、0.9520 mg/mL、0.6360 mg/mL、0.6800 mg/mL的对照品贮备液，备用。精密吸取盐酸小檗碱对照品贮备液1.2 mL，盐酸巴马汀对照品贮备液0.5 mL，盐酸黄连碱对照品贮备液1.0 mL，盐酸表小檗碱对照品贮备液0.7 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇-盐酸 (100∶1)稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取样品粉末各约0.1 g(过60目筛)，精密称定，置150 mL锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸 (100∶1)的混合液50 mL，称定质量，超声 (250 W，40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇-盐酸 (100∶1)的混合液补失质量，过滤，微孔滤膜 (0.22 μm)滤过，取续滤液得各供试品溶液。

2.4 线性范围考察 精密吸取2.2项下的混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 μL注入高效液相色谱仪，测定色谱峰面积。以进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸表小檗碱的回归方程分别为:Y=2355830.78X－106694.99，r=0.9996；Y=3176270.75X －41517.90，r=0.9997；Y=2136177.61X －2389.44，r=0.9995；Y=2154179.15 X －27944.69，r=0.9996。结果表明，盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱和盐酸表小檗碱分别在0.1578～1.578 μg，0.0476 ～ 0.476 μg，0.0636 ～ 0.636 μg，0.0416～0.416 μg线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按2.1项下操作，重复进样6次，测得盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱峰面积的RSD值分别为2.4%、2.1%、1.9%、1.0%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液 (120℃胆汁润黄连)，室温下放置，于0、2、4、6、8、10、12、24 h时间间隔，分别进样分析，按2.1项下操作，测定盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱峰面积的RSD值分别为1.3%、1.1%、1.9%、1.4%，结果表明供试品溶液于室温下在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取同一样品6份(120℃胆汁润黄连)，按2.3项供试品溶液制备项下方法操作，在2.1项色谱条件下进行测定，测得各样品中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸黄连碱、盐酸表小檗碱的RSD值分别为0.8%、1.1%、1.8%、2.3%，证明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知盐酸小檗碱 (49.70 mg/g)、盐酸巴马汀 (8.23 mg/g)、盐酸黄连碱(13.15 mg/g)和盐酸表小檗碱 (7.00 mg/g)含有量的药材 (生黄连)6份，每份约0.05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸表小檗碱对照品贮备液0.50 mL(0.6800 mg/mL)、盐酸黄连碱对照品贮备液1.00 mL(0.6360 mg/mL)、盐酸巴马汀对照品贮备液0.30 mL(0.9520 mg/mL)、盐酸小檗碱对照品贮备液2.00 mL(1.3150 mg/mL)于具塞锥形瓶中，按2.3项下方法制备供试品溶液并进样分析，结果见表1。

2.9 炮制品的制备

2.9.1 直接烘干品 取净生黄连片4份，每份20 g，分别在温度为 120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放凉，备用。

2.9.2 60%胆汁润烘干品 取净生黄连片4份，每份20 g，分别加入胆汁12 g，至密闭容器内，拌匀，闷润6 h后，分别在温度为120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放凉，备用。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.9.3 60%酒润烘干品 取净生黄连片4份，每份20 g，分别加入黄酒12 g，至密闭容器内，拌匀，闷润6 h后，分别在温度为120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放凉，备用。

2.9.4 12.5%酒润烘干品 取净生黄连片4份，每份20 g，分别加入黄酒2.5 g，至密闭容器内，拌匀，闷润6 h后，分别在温度为120℃、140℃、160℃、180℃的烘箱中烘制10 min后，取出，放凉，备用。

2.10 样品的测定 取黄连各炮制品，按照供试品试液制备方法操作，分别精密吸取各供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，分别代入标准曲线，计算样品中各组分。结果见表2～表5。

由表2到表5中数据可以看出，黄连不同炮制品的4种生物碱含有量随着温度的升高呈降低趋势，且黄连直接烘干品下降幅度最大。其次为12.5%酒润烘干品。4种炮制品的表小檗碱和黄连碱含有量均随着温度的升高而降低。四个温度下，4种炮制品中巴马汀含有量差别不明显。120℃时，生物碱总体上的含有量大致为12.5%酒润烘干品＞60%酒润烘干品＞直接烘干品＞胆汁润烘干品；140℃时，12.5%酒润烘干品＞直接烘干品＞60%酒润烘干品＞胆汁润烘干品；160℃时，60%酒润烘干品＞胆汁润烘干品＞12.5%酒润烘干品＞直接烘干品；180℃时，60%酒润烘干品＞胆汁润烘干品＞直接烘干品＞12.5%酒润烘干品。

表2 120℃不同炮制品4种生物碱Tab.2 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 120℃

表3 140℃不同炮制品4种生物碱Tab.3 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 140℃

表4 160℃不同炮制品4种生物碱Tab.4 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 160℃

表5 180℃不同炮制品4种生物碱Tab.5 Determination of four alkaloids in Coptis chinensis processed with four methods at 180℃

3 讨论

3.1 本实验参考了乙腈-0.1%磷酸溶液 (50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)［7］，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液 (28∶72)(磷酸调节pH 为3.0)［8］，乙腈-水 (45 ∶55，内含磷酸二氢钾0.34 g，十二烷基硫酸钠0.17g)［3］，以及乙腈(A)-0.3%磷酸三乙胺 (B)进行梯度洗脱［9］等色谱条件，并对其进行考察，结果发现在本实验中分离度不好，故将流动相做调整，最终确定流动相为乙腈-水 (45∶55)，内含KH2PO43.4 g/L，SDS 1.7 g/L(再以磷酸调节pH为3.0)。该流动相条件可将黄连中待测生物碱达到最好的分离效果。

3.2 前期考察胆黄连中胆汁的加入量时发现60%的综合评分最高，所以本实验采用了60%的胆汁润烘干品。为了保证辅料量一致，黄连酒润烘干品也加入了60%的黄酒。本实验也额外考察了2010年版《中国药典》［10］中酒黄连的炮制方法，即加入12.5%的黄酒。

3.3 在不同温度下，60%酒润烘干品中生物碱的含有量大体上均高于胆汁润烘干品。结果显示，加入相同量的黄酒与胆汁相比，生物碱的溶出率更高。

3.4 在同一温度下，黄连4种炮制品中巴马汀含有量差别不明显，推测巴马汀不为黄连中的寒性成分。

3.5 研究发现，在40 min烘制时间下，随着温度的升高，烘制品中部分盐酸小檗碱转化成小檗红碱，从而使小檗碱的含有量降低［11］。降雪等［12］发现酒黄连在170℃时产生小檗红碱这种新的成分。本研究小组也发现经高温烘制的巴马汀分离出来的一种成分也可以在烘制后的黄连中检测到。因此，随着温度的升高，黄连中的某些生物碱遇热，结构被破坏，生成新的化学成分，使得原来的生物碱含有量降低。

3.6 由以上数据可以看出，黄连炮制品中生物碱的含有量与辅料的加入量和炮制温度有关。不能单纯地只通过观察在同一个温度下炮制的胆黄连和酒黄连中生物碱的含有量而推断生物碱量的多少与黄连的寒热药性有关。

3.7 不同炮制品中，黄连直接烘干品中生物碱下降幅度最大，推测辅料对黄连中生物碱有保护作用。12.5%酒润烘干品比60%酒润烘干品中生物碱下降幅度大，可能是辅料量增多，在加热过程中可以吸收一部分热量，从而避免温度升高对黄连中生物碱的破坏。黄连直接烘干品和12.5%酒润烘干品随着温度的升高，因为辅料量少，所以生物碱易被破坏，生成小檗红碱等其他成分。而目前尚不明确这类新生成成分与黄连寒热的关系，有待进一步的研究。

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